發(fā)布時間：2024-05-12 06:30

　　細胞周期受各種細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin dependent kinases,CDKs)/細胞周期蛋白(Cyclins)復合體的嚴格調(diào)控,細胞周期調(diào)控機制出現(xiàn)異常與衰老、動脈硬化、阿爾茲海默癥、腫瘤等各種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān),所以至今對細胞周期的研究依然十分重要。癌癥死亡率世界排名第二,嚴重影響人們生命安全和生活水平。細胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常便會使細胞擺脫了嚴密的控制進入無限循環(huán),是腫瘤發(fā)生發(fā)展的最基本原因。p21幾乎可以和所有的Cyclins/CDKs復合體結(jié)合,抑制復合體功能,對準確的細胞周期運轉(zhuǎn)十分重要。在許多腫瘤組織中p21的表達量都表現(xiàn)為顯著降低,并且p21很少發(fā)生突變,因此闡明它的表達調(diào)控機制對深入理解細胞周期紊亂與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系極為重要。因此,課題組構(gòu)建了一個包含3,354個shRNA表達載體的shRNA文庫并利用含有p21啟動子的報告基因體系,進行針對p21轉(zhuǎn)錄調(diào)控的高通量篩選。通過該篩選我們發(fā)現(xiàn)了多個新的p21上游調(diào)控因子。本論文中,我們針對通過上述篩選體系發(fā)現(xiàn)的p21后補抑制因子中的XBP1及ZER6對p53和p21的分子調(diào)控機制進行詳細、深入的研究...

【文章頁數(shù)】：149 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英漢縮略詞表
1 前言
    1.1 研究意義
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 細胞周期調(diào)控
        1.2.2 細胞周期抑制因子p21與腫瘤
    1.3 研究目標
    1.4 本課題創(chuàng)新點
    1.5 研究方案
2 實驗材料和方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 儀器
        2.1.2 試劑耗材
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 細胞實驗
        2.2.3 動物實驗
        2.2.4 臨床組織樣本
        2.2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>        2.2.6 RNA提取和實時定量PCR(q PCR)
        2.2.7 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析
        2.2.8 CCK-8 測定細胞數(shù)量
        2.2.9 EdU標記細胞增殖實驗和集落形成實驗
        2.2.10 集落形成實驗
        2.2.11 細胞周期分析
        2.2.12 蛋白質(zhì)半衰期測定
        2.2.13 免疫共沉淀(以免疫沉淀MDM2,XBP1-u為例)
        2.2.14 連續(xù)免疫沉淀(以p53/MDM2/XBP1-u的連續(xù)免疫沉淀為例)
        2.2.15 細胞內(nèi)泛素化測定(以測定p53 的泛素化為例)
        2.2.16 體內(nèi)化學交聯(lián)測定
        2.2.17 體外泛素化測定
        2.2.18 GST pull-down實驗
        2.2.19 His融合蛋白的制備
        2.2.20 His pull-down實驗
        2.2.21 免疫組化分析
        2.2.22 免疫熒光染色
        2.2.23 統(tǒng)計分析
第一部分
    3 應用shRNA表達質(zhì)粒文庫對p21轉(zhuǎn)錄活性進行高通量篩選
        3.1 引言
        3.2 實驗目的
        3.3 實驗結(jié)果與討論
            3.3.1 驗證用shRNA表達質(zhì)粒文庫篩選p21調(diào)控因子方法的可行性
            3.3.2 利用shRNA表達質(zhì)粒文庫和p21報告基因系統(tǒng)大量篩選p21轉(zhuǎn)錄調(diào)控候補因子
        3.4 本章小結(jié)
第二部分 探討XBP1-u對p21轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機制及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響
    4 XBP1-u負調(diào)控p21轉(zhuǎn)錄活性
        4.1 引言
        4.2 實驗目的
        4.3 實驗結(jié)果與討論
            4.3.1 確認XBP1對p21轉(zhuǎn)錄水平的影響
            4.3.2 探討XBP1對p21轉(zhuǎn)錄調(diào)控的普遍性
            4.3.3 探討XBP1 兩種剪切體對p21轉(zhuǎn)錄水平的作用機制
            4.3.6 XBP1-u/p21通路對細胞周期及細胞增殖的影響
        4.4 本章小結(jié)
    5 探討p53在XBP1-u對 p21轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用機制
        5.1 前言
        5.2 實驗目的
        5.3 實驗結(jié)果與討論
            5.3.1 探討p53在XBP1-u/p21信號通路中的作用機制
            5.3.2 解析XBP1-u對 p53 表達水平的調(diào)控機制
        5.4 本章小結(jié)
    6 探討XBP1-u調(diào)控p53 泛素化的分子機制
        6.1 前言
        6.2 實驗目的
        6.3 實驗結(jié)果與討論
            6.3.1 考察MDM2在XBP1-u通過調(diào)控p53/p21通路中的影響
            6.3.2 考察XBP1-u對 MDM2 表達水平的影響
            6.3.3 探討XBP1-u對 MDM2 蛋白質(zhì)水平的分子調(diào)控機制
            6.3.4 考察影響MDM2 蛋白穩(wěn)定的XBP1-u關(guān)鍵區(qū)域
        6.4 本章小結(jié)
    7 XBP1-u/MDM2 通路對腫瘤發(fā)生十分關(guān)鍵
        7.1 前言
        7.2 實驗目的
        7.3 實驗結(jié)果與討論
            7.3.1 在動物水平上探討XBP1-u/MDM2 通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用
            7.3.2 考察臨床結(jié)腸癌樣本中XBP1-u與 MDM2 及下游因子表達情況
        7.4 本章小結(jié)
    8 探討XBP1-u與 MDM2對p53 的共同協(xié)調(diào)作用
        8.1 前言
        8.2 實驗目的
        8.3 實驗結(jié)果與討論
            8.3.1 高表達情況下的XBP1-u和 MDM2對p53 的作用
            8.3.2 XBP1-u的功能與MDMX無關(guān)
        8.4 本章小結(jié)
    9 第二部分結(jié)論與討論
第三部分 鋅指蛋白p52-ZER6 通過促進p53 泛素化促進細胞增殖和腫瘤發(fā)展
    10 探討ZER6對p53和p21的分子調(diào)控機制
        10.1 前言
        10.2 實驗目的
        10.3 實驗結(jié)果與討論
            10.3.1 ZER6 亞型對P53及P21 表達量的影響
            10.3.2 探討p52-ZER6對p53 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響
            10.3.3 考察p52-ZER6、p53 以及MDM2 蛋白質(zhì)之間的結(jié)合
            10.3.4 探討p52-ZER6 促進MDM2 誘導p53 蛋白質(zhì)泛素化的分子機制
        10.4 本章小結(jié)
    11 p52-ZER6 通過TKRAB結(jié)構(gòu)域調(diào)控MDM2/p53 通路
        11.1 前言
        11.2 實驗目的
        11.3 實驗結(jié)果與討論
            11.3.1 分析p52-ZER6的N端和C端的細胞內(nèi)分布
            11.3.2 考察p52-ZER6 蛋白質(zhì)N端在調(diào)控MDM2/p53 通路的功能
            11.3.3 探討p52-ZER6 蛋白質(zhì)N端各結(jié)構(gòu)域在調(diào)控MDM2/p53 通路的功能
        11.4 本章小結(jié)
    12 HUB-1 結(jié)構(gòu)域抑制p52-ZER6對p53 的調(diào)控
        12.1 前言
        12.2 實驗目的
        12.3 實驗結(jié)果與討論
        12.4 本章小結(jié)
    13 第三部分結(jié)論與討論
全文總結(jié)與展望
參考文獻
附錄
    A.作者在攻讀學位期間發(fā)表的論文目錄
    B.作者在攻讀學位期間主持或參與的基金項目
    C.作者在攻讀學位期間獲得的獎項
    D.學位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：3971001