藍莓酒渣花色苷的提取及抗氧化活性研究
發(fā)布時間：2016-03-21 09:51
第一章 緒論
1.1.1 藍莓種類
藍莓主要分布區(qū)域在北半球的溫帶和亞熱帶，全球共有藍莓品種約 400 余種。中國約有 100 余種藍莓品種及其變種，分布地區(qū)集中在西南和東北一帶。我國主要栽培品種有三類，即高叢藍莓（Vac-cinium corymbosum）、矮叢藍莓（Vaccinium chamaebuxus）和兔眼藍莓（Vaccinium ashei）[3-4]。高叢藍莓又可分為北高叢藍莓、南高叢藍莓和半高叢藍莓，它的種植面積是目前世界人工種植面積最大的藍莓品種，在北溫帶和亞熱帶是其商業(yè)種植的集中區(qū)域。其中北高叢藍莓適宜種植在北方，而南高叢藍莓適宜在南方種植，半高叢藍莓是高叢藍莓和矮叢藍莓的雜交品種，也適合種植在北方。矮叢藍莓在美國和加拿大分布廣泛，適宜栽植在北方寒冷地區(qū)[5]。兔眼藍莓的原產(chǎn)地位于北美洲，其生長能力強、耐 pH值幅度大、休眠期短、需水期短，極其適合在我國南方地區(qū)推廣種植[6]。
1.1.2 藍莓營養(yǎng)價值
藍莓是美國農(nóng)業(yè)部營養(yǎng)研究中心研究過的多種水果蔬菜中抗氧化活性成分含量最高的。藍莓果肉細膩，富含維生素和多種礦物質(zhì)，已在藍莓漿果中檢測到了 19 種氨基酸，其中有 8 種是人體所需要的必需氨基酸[7]。每 100g 新鮮藍莓果中，有 400-700mg 的蛋白質(zhì)、500-600mg 的脂肪、12.3-15.3g 的碳水化合物、81-100 IU 的 VA，還有大量的多酚和黃酮類物質(zhì)，花色苷含量是其他植物的很多倍[8]。正因為藍莓含有很高的營養(yǎng)價值，現(xiàn)如今各種藍莓制品已風(fēng)靡全球，成為人們?nèi)找嫱瞥绲谋＝∈称贰?br /> 1.1.3 藍莓分布利用情況
全球的越桔屬植物共有 400 余種，集中生長于北半球的亞熱帶等地區(qū)。我國野生藍莓資源主要集中分布在吉林長白山和黑龍江大、小興安嶺一帶，據(jù)估算我國野生藍莓的年產(chǎn)量約為 100 萬噸，而藍莓加工廠年加工總量在 1000 噸以下，約為野生產(chǎn)量的 0.1%。
野生藍莓采摘困難且口感不好，一直以來沒有得到足夠的重視，但隨著藍莓營養(yǎng)價值日益被人們所了解，現(xiàn)在野生藍莓的產(chǎn)量已經(jīng)變的供不應(yīng)求，這使藍莓的種植有了廣闊的發(fā)展空間。現(xiàn)在種植藍莓的主要地區(qū)主要有長白山、大小興安嶺，遼東、膠東半島，長江地區(qū)和華南一帶[9-11]。
......
花色苷是由花青素與糖結(jié)合而成，花青素的基本結(jié)構(gòu)是 3，5，7-三羥基-2-苯基苯并毗喃，也被叫做花色基元（見圖 1-1）。花色苷結(jié)構(gòu)中含有 C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，花色苷的配基能夠和糖結(jié)合形成配糖體。由于花青素極不穩(wěn)定，多數(shù)的 3，5，7 碳位被羥基取代，其它位置上的取代基也不相同，這樣花青素就分為很多種，自然界中以游離形式的花青素很少，多以花色苷的形式存在。現(xiàn)在已知的花青素一共有 6 種（見表 1-1）。能與花青素結(jié)合生成糖苷鍵的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等單糖，以及這些單糖形成的二糖或三糖，最常見的有 3-單糖苷、5-雙糖苷、3，5-二糖苷和 3，7-二糖苷[32]。
花色苷的提取方法有很多，常用的有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法和酶法輔助提取法等。其中最常用的是溶劑萃取法，不同原料中的花色苷種類和含量都不相同，所以通常根據(jù)目標(biāo)提取物的屬性來選擇何種提取方法。如果目的是為了定性、定量，那么提取方式不能破壞花色苷的結(jié)構(gòu)；如果目的是為了保持色素穩(wěn)定，當(dāng)做食品添加劑使用，則應(yīng)以提取率為指標(biāo)，減少顏色的變化并保持其穩(wěn)定性不變。
天然色素最常用的提取方法是溶劑提取法，溶劑提取法的關(guān)鍵是選擇合適的提取劑。選擇合適的提取劑，不僅要考慮到對目標(biāo)提取物應(yīng)有較大的溶解度，還要避免溶解大量雜質(zhì)，還應(yīng)對成本、安全性、對環(huán)境的污染和回收等因素加以考慮。有研究表明，在食品領(lǐng)域提取花色苷時，最好采用無毒的乙醇。由于花色苷在酸性條件下穩(wěn)定，用鹽酸酸化可以使提取液 pH 較低，能夠提高花色苷提取率，并保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。徐美玲等[35]用溶劑提取法提取藍莓果中的花色苷，提取率達到 5.8%。張學(xué)寧等[36]比較了水浴法、微波法和超聲波法對藍莓果實花色苷的最佳提取工藝，結(jié)果顯示：超聲波法適于北陸和喬治 2 個品種。
借助超聲波技術(shù)來提取花色苷，其原理是：超聲波的空化作用可以破壞植物細胞的細胞壁，使溶劑擴散速率加快，最后可經(jīng)分離獲取目標(biāo)物質(zhì)，超聲波技術(shù)的優(yōu)點很多，目前在中草藥提取方面應(yīng)用的最多[37-38]。花色苷熱穩(wěn)定性極差，可以用超聲波輔助萃取來降低提取的溫度，避免花色苷在高溫時發(fā)生降解。李雙石等[39]應(yīng)用超聲波法萃取葡萄皮渣中的花色苷，結(jié)果花色苷的提取量又顯著的提高。陳鋼等[40]用超聲波提取黑莓果中的花色苷，結(jié)果表明，黑莓花色苷溶液還原力高于VC。
......
第二章 藍莓酒渣花色苷提取工藝的研究
......
2.2 試驗方法
2.2.1 工藝流程藍莓酒渣→40℃烘干至恒重→粉碎過 60 目篩→提取液提取→抽濾→濾液定量測定
取一定量的藍莓酒渣粉在不同條件下提取，提取液過濾后定容到一定體積，稀釋一定倍數(shù)后，分別測量花色苷、總酚和總黃酮的吸光值，計算其提取量。
2.2.2 藍莓酒渣基本指標(biāo)測定
2.2.2.1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定
（1）pH 1.0 與 pH 4.5 緩沖溶液的配制：
精確稱取氯化鉀 0.373mg，溶于 25mL 蒸餾水中，在加入 1.107mL 濃鹽酸（體積分?jǐn)?shù)37%、濃度 12.1mol/L），混勻后即為 pH 1.0 的緩沖溶液，放入冰箱備用。
精確稱取 2.772g 三水合醋酸鈉，溶于 20mL 蒸餾水中，在加入 0.992mL 濃鹽酸（體積分?jǐn)?shù) 37%、濃度 12.1mol/L），混勻后在加入 30mL 蒸餾水，混勻后即為 pH 4.5 的緩沖溶液，放入冰箱備用。
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
花色苷(ACY)含量的測定采用 pH 示差法[121]，根據(jù)李安文[122]的方法進行改進。精確稱取 7.2mg 矢車菊素 3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后定容到 10mL 作為母液，分別稀釋到濃度為 0.012mg/mL、0.024mg/mL、0.036mg/mL、0.048mg/mL、0.072mg/mL，分別用 pH1.0 和pH4.5 的緩沖液定容至 10mL，分別在 520nm 與 700nm 處測定溶液的吸光度，代入公式 2-1計算吸光值 A，以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光值 A 為縱坐標(biāo)繪制花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.2.2.2 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照蔡義忠等[123]的 Folin-Ciocalteu 比色法進行多酚含量的測定。精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 10mg，用水溶解并定容到 100mL，得 0.1mg/mL 的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0、1、2、3、4、5mL 于 10mL 容量瓶中，各加 2mL 福林試劑，搖勻，4min 后，加入 7.5% Na2CO3溶液 2mL，用蒸餾水定容，充分混合后避光反應(yīng) 2h，在 760nm 波長測定溶液吸光值 A，以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光值 A 為縱坐標(biāo)繪制總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.2.2.3 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
總黃酮采用蘆丁為參比標(biāo)準(zhǔn)，用分光光度法測定[124]。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 10mg，用95%乙醇溶解后，配制成 0.2mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，放入冰箱備用。用移液槍分別準(zhǔn)確吸取貯備液 0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于 10mL 容量瓶中，分別加入 50%乙醇使成容量瓶中液體達到 5mL 后，加入 5% NaNO2溶液 0.3mL，6min 后加入 10%Al(NO3)3溶液 0.3mL，再過 6min 后加入 4 %NaOH 溶液 4mL，用 50%乙醇定容，搖勻后靜置 l5min，在 510nm 處分別測吸光值 A，以濃度 C 為橫坐標(biāo)，吸光值 A 為縱坐標(biāo)繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.2.3 溶劑法提取藍莓酒渣中花色苷、總酚、總黃酮
將藍莓酒渣 40℃烘干，用高速粉碎機粉碎，粉末過不同目數(shù)的篩子，稱取 1g 酒渣，置于 100mL 錐形瓶中，在不同提取條件下提取后抽濾，濾液稀釋一定倍數(shù)后測量花色苷、總酚、總黃酮的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各物質(zhì)的提取量。對各工藝參數(shù)進行優(yōu)化后，選擇對提取效率影響顯著的因素設(shè)計正交實驗，通過正交分析，得出最佳實驗參數(shù)。
......
3.1 試驗材料與儀器.......................................... 34
3.1.1 主要材料與試劑 ...................................... 34
3.1.2 試驗儀器.............................................. 34
3.2 試驗方法................................................. 34
3.4 結(jié)論 .................................................... 48
第四章 藍莓酒渣花色苷穩(wěn)定性研究 ...............................49
4.1 試驗材料與儀器 ......................................... 49
4.1.1 主要材料與試劑 .................................... 49
4.1.2 主要儀器設(shè)備 ......................................... 50
第五章 藍莓酒渣花色抗氧化性研究 ..........................61
5.1 試驗材料與儀器 ......................................... 61
5.1.1 主要材料與試劑 ..................................... 61
5.1.2 主要儀器設(shè)備 ..................................... 62
第五章 藍莓酒渣花色抗氧化性研究
在抗氧化等功能性食品的研發(fā)過程中，通常通過體內(nèi)和體外的抗氧化能力來衡量其抗氧化能力。由于體內(nèi)實驗受到諸多條件的限制，所以體外實驗應(yīng)用的更加廣泛。通常體外抗氧化實驗有 DPPH 法、羥基自由基清除法、抗超氧陰離子自由基清除法、ABTS 法和測定總抗氧化能力等方法。這些方法中每種方法都有各自的檢測意義，通過不同方法得出的數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性不大。本實驗中采用了羥基自由基清除法、DPPH 法、抗超氧陰離子自由基清除法和總抗氧化能力的測定，對藍莓酒渣花色苷純化物和粗提物的抗氧化活性進行比較。
5.2.1 藍莓酒渣花色苷對羥自由基的清除能力
參照 Blois 等[160]的方法略作改動，，配制 0.2mmol/L 的 DPPH 溶液，放于棕色瓶中在 4℃冷藏保存，在比色管中加入不同濃度的藍莓酒渣花色苷溶液和 DPPH 溶液各 2mL，充分混合后在室溫避光下放置 30min，在 517nm 處測定溶液的吸光值�？瞻捉M為 1.5mL 乙醇溶液和 1.5mL 一定濃度的藍莓酒渣花色苷溶液；對照組為 1.5mL 乙醇溶液和 1.5mLDPPH 溶液，以 VC作為對照。清除率（E）計算公式如 5-2：
參照郭雪峰[161]方法略作改動，依次加入濃度為50mmol/L Tris-HCl緩沖液5.7mL，樣品溶液0.2mL，濃度為6mmol/L鄰苯三酚溶液0.1mL，混合反應(yīng)4min，滴入2滴HCl終止反應(yīng)，在320nm處測量。根據(jù)公式5-3計算出單位時間內(nèi)吸光度值的變化，以VC作為對照。計算超氧陰離子的清除率公式如下：
二苯基苦味肼基自由基（DPPH）是一種穩(wěn)定的有機自由基，可用來評價抗氧化物質(zhì)的供氫能力，在517nm處有特征吸收峰，當(dāng)DPPH中加入的被測物質(zhì)中有抗氧化劑時，抗氧化劑就會與孤對電子配對，使其在517nm處的吸光度值減小。因此可根據(jù)吸光度值的變化來評價對DPPH自由基的清除能力[165]。
總抗氧化能力是物質(zhì)的不同活性成分清除各種類型自由基的有效和，抗氧化活性物質(zhì)在機體內(nèi)起效果的是其總抗氧化能力，因此用總抗氧化能力(TAA)評價生物活性物質(zhì)的抗氧化功能是非常重要的指標(biāo)[167]。通常樣品中抗氧化物質(zhì)的含量與其總還原能力呈正相關(guān)，依據(jù)還原能力的測定原理，在波長 700nm 處測定的吸光值越大，則樣品的還原能力越強。如圖 5-1-A 和 5-1-B 所示，在一定的濃度范圍內(nèi)，藍莓酒渣花色苷純化物和粗提物的還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且藍莓酒渣花色苷的總抗氧化能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強，說明吸光度和質(zhì)量濃度基本上呈現(xiàn)正比關(guān)系；且在不同質(zhì)量濃度下，藍莓酒渣花色苷純化物的總還原能力均高于粗提物。但純化物和粗提物的總抗氧化能力均低于 VC，藍莓酒渣花色苷純化物和粗提物的濃度為 20μg/mL 時，吸光值分別為 0.139 和 0.083，VC的濃度為 20μg/mL 時，吸光值達到了 0.652，VC的總抗氧化能力是藍莓酒渣花色苷純化物的 4.7 倍和 7.5 倍。
......
第六章 結(jié)論與建議
花色苷有抗癌、抗炎等作用，是目前食品的人們研究對象。本文創(chuàng)新性的從藍莓酒渣中提取花色苷，采用溶劑提取法提取野生和種植酒渣中花色苷、總酚和總黃酮含量的差異，并達到了較好的提取效果，并對野生藍莓酒渣粗提物通過大孔樹脂法進行純化，并用反相高效液相色譜質(zhì)譜對藍莓酒渣花色苷進行組成成分分析，對純化后的藍莓酒渣花色苷產(chǎn)品進行穩(wěn)定性和抗氧化性研究，結(jié)果表明其穩(wěn)定性極差，但抗氧化性極強。
（1）溶劑提取法提取野生和種植兩種藍莓酒渣中花色苷的工藝參數(shù)，得到最佳的提取工藝參數(shù)。野生藍莓酒渣最佳實驗參數(shù)為：提取劑為 40 %乙醇，添加 0.1 %的鹽酸，料液比 1：40，30℃提取 1 h，提取液中花色苷含量為 3.03 mg/g，總酚 4.52 mg/g，總黃酮 1.85mg/g，粗提物得率 22.1 %，花色苷純度 1.37 %。種植藍莓酒渣最佳實驗參數(shù)為：提取劑為40 %乙醇，添加 0.1 %的鹽酸，料液比 1：30，30℃提取 1 h，提取液中花色苷含量為 2.14 mg/g，總酚 3.34 mg/g，總黃酮 1.37 mg/g，粗提物得率 17.6 %，花色苷純度 0.89 %，結(jié)果表明，野生藍莓酒渣中殘留花色苷、總酚和總黃酮含量均高于種植藍莓酒渣，粗提物得率和花色苷純度也由于種植藍莓酒渣。
（2）藍莓酒渣花色苷純化實驗采用樹脂法對藍莓酒渣粗提物進行純化。通過靜態(tài)吸附解吸實驗比較 5 種型號的大孔樹脂對藍莓酒渣的吸附能力，結(jié)果顯示 NKA-II 型大孔樹脂對藍莓酒渣花色苷純化效果較好。NKA-II 型大孔樹脂對藍莓酒渣花色苷純化的工藝條件為：藍莓酒渣花色苷粗提液上樣濃度為 0.8mg/mL，pH 調(diào)整為 3，上樣流速為 1mL /min，洗脫劑為體積分?jǐn)?shù) 40%乙醇溶液，洗脫流速為 1.0mL/min。純化后藍莓酒渣花色苷產(chǎn)品為紫黑色粉末，色價為 90.57，純度為 27.6%。并從純化物中檢測出 5 種花色苷單體，推測為芍藥色素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-半乳糖苷、牽牛花色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3 葡萄糖苷、錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷。
......
參考文獻（略）
本文編號：36399
本文鏈接：http://www.wukwdryxk.cn/wenshubaike/lwfw/36399.html
最近更新
教材專著
