發(fā)布時間：2020-12-15 10:01

　　第一部分:誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞及差異表達(dá)MicroRNAs的篩選目的:篩選出hiPSCs體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)神經(jīng)前體細(xì)胞過程中表達(dá)有差異的microRNAs,與經(jīng)典WNT信號通路進(jìn)行比對分析篩選到miR-125a-5p。方法:分組:1)實(shí)驗(yàn)組:LSB/SHH/FGF8b/CHIR99021+N2/B27誘導(dǎo)組;2)對照組:單純N2/B27誘導(dǎo)組。在體外將hiPSCs向多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化,免疫細(xì)胞化學(xué)、實(shí)時定量PCR（qRT-PCR）法檢測hiPSCs向DA能神經(jīng)前體細(xì)胞分化過程中不同階段細(xì)胞:神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、底板細(xì)胞標(biāo)志物Foxa2、DA能神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物En1、神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1及DA能神經(jīng)元標(biāo)志物TH的表達(dá)。提取實(shí)驗(yàn)組hiPSCs、神經(jīng)前體細(xì)胞、DA能神經(jīng)前體細(xì)胞3個階段的細(xì)胞的總RNA進(jìn)行microRNAs高通量測序,篩選出差異表達(dá)的microRNAs,與經(jīng)典WNT信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行相關(guān)性分析篩選出適當(dāng)?shù)膍icroRNA用于研究。結(jié)果:在誘導(dǎo)分化過程中,神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）階段（誘導(dǎo)分化第7天）細(xì)胞基本... 

【文章來源】：廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

hiPSCs向多巴胺能前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化光鏡下細(xì)胞形態(tài)圖：A.hiPSCs克�。籸iment

23第一部分：誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞及miR-125a-5p的篩選3.2誘導(dǎo)分化第7天神經(jīng)干細(xì)胞階段免疫細(xì)胞化學(xué)和qRT-PCR檢測結(jié)果對分化至第7天的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物NESTIN與底板神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物FOXA2的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組（Experiment）和對照組（Control）NESTIN+細(xì)胞（紅色）數(shù)量無明顯差異，但FOXA2+細(xì)胞（綠色）實(shí)驗(yàn)組較對照組明顯增多（圖2A）。提取兩組細(xì)胞總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞NESTIN的mRNA表達(dá)較對照組無明顯差異（P>0.05），而實(shí)驗(yàn)組的FOXA2的mRNA表達(dá)較對照組明顯增高（圖2B）(P<0.001)。BFOXA2NESTIN圖2:誘導(dǎo)分化第7天神經(jīng)干細(xì)胞階段相關(guān)基因的免疫細(xì)胞化學(xué)及qRT-PCR檢測結(jié)果。A.對照組與實(shí)驗(yàn)組hiPSCs誘導(dǎo)分化第7天Nestin/FOXA2免疫熒光染色（標(biāo)尺=100μm）。B.對照組與實(shí)驗(yàn)組hiPSCs誘導(dǎo)分化第7天NESTIN和FOXA2的mRNA表達(dá)。（***P<0.001）。AControlExperimentControlExperiment

25第一部分：誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞及miR-125a-5p的篩選B圖3:誘導(dǎo)分化第25天神經(jīng)元階段相關(guān)基因的免疫細(xì)胞化學(xué)及qRT-PCR檢測結(jié)果。A.對照組與實(shí)驗(yàn)組TH(紅色)與TUJ1（綠色）免疫熒光染色（標(biāo)尺=50μm）。B.分化第25天的兩組細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)量比較。（*P<0.05;**P<0.01）。3.4HiPSCs向多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中不同階段細(xì)胞microRNAs的高通量測序?qū)�擬進(jìn)行高通量測序的RNA樣品進(jìn)行RNA完整性的檢測，結(jié)果顯示各組RNA的5S表達(dá)量不高，條帶不明顯，18S和28S均顯示有明顯條帶，且28S比18S的表達(dá)量高。這表明樣品RNA沒有被降解，完整性良好（圖4A）。0天hiPSCs（S01）、實(shí)驗(yàn)組7天NSCs(S02)及實(shí)驗(yàn)組25天DA能神經(jīng)前體細(xì)胞(S03)經(jīng)過microRNAs高通量測序分析后，篩選出差異有統(tǒng)計學(xué)意義的遞增表達(dá)的miRNAs（圖4B）。AControlExperiment

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Mir-125a與相關(guān)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 范忠義,焦順昌.  解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2015(11)
[2]The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J]. Wenwen Jia,Wen Chen,Jiuhong Kang.  Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2013(05)



本文編號：2918090