發(fā)布時間：2020-11-19 13:32

　　 背景:Ⅰ型膠原蛋白的免疫原性主要分布在分子鏈的端肽區(qū)域,可在膠原蛋白提取過程中通過水解或是去除而使其失活,制備去端肽Ⅰ型膠原蛋白,降低其免疫原性。目的:評價去端肽Ⅰ型膠原蛋白的免疫原性。方法:采用酶切、鹽析、透析工藝制備去端肽Ⅰ型膠原蛋白,通過考馬斯亮藍對牛血清白蛋白染色極限的分析,鑒定去端肽Ⅰ型膠原蛋白的純度,依據YY/T0606.25-2014中規(guī)定的方法,利用Quant-ITPicoGreen dsDNA Reagent and Kits試劑盒測定去端肽Ⅰ型膠原蛋白的DNA殘留量,利用ELISA試劑盒分析去端肽Ⅰ型膠原蛋白的端肽去除效果,依據YY/T 1561-2017標準檢測去端肽Ⅰ型膠原蛋白的α-Gal抗原含量。結果與結論:去端肽Ⅰ型膠原蛋白的純度可達99.8%,DNA殘留量為4μg/g,C、N末端肽濃度低于試劑盒檢測限,α-Gal抗原含量低于檢測限。通過酶切、鹽析、透析工藝制備的去端肽Ⅰ型膠原蛋白,可顯著去除天然膠原蛋白的免疫原性根源,有效控制膠原蛋白臨床應用的免疫原性風險。
【部分圖文】：

?C端肽標準品，上海廣銳生物科技有限公司提供，批號：201608；牛Ⅰ型膠原N端肽標準品，上海廣銳生物科技有限公司提供，批號：201608。去端肽Ⅰ型膠原蛋白為白色或淡黃色海綿狀固體。膠原蛋白海綿具有網狀多孔支架結構，在掃描電鏡下觀察到膠原海綿表面呈纖維狀，見圖2所示，其孔徑大小在500nm以內；在透射電鏡下觀察膠原蛋白海綿纖維結構，200nm條件下可清晰地看到膠原纖維形態(tài)上呈現“橫紋帶或橫紋褶皺”，見圖3中箭頭所示，而這橫紋帶或橫紋褶皺正是Ⅰ型膠原三螺旋纖維的典型表現[8-9]。圖1Ⅰ型膠原蛋白三螺旋結構Figure1Triple-helicalstructureoftypeIcollagen

量濃度分別為0.016，0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4mg/L的Gal-牛血清白蛋白標準品。將裂解好的樣本和標準曲線樣本分別與等體積抗α-Gal抗體反應，靜置、離心后，取適當上清液與固相抗原反應，依照ELISA法對樣本殘留的抗α-Gal抗體進行檢測。1.6統(tǒng)計學分析數據采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布數據用x_±s表示，將數據進行方差分析。當P≤0.01時表示差異有非常顯著性意義，當P≤0.05時表示差異有顯著性意義。圖2掃描電鏡下膠原蛋白海綿三維多孔網狀支架結構Figure2Three-dimensionalporousreticularscaffoldstructureofcollagenspongeunderelectronmicroscope圖注：可清晰地看到膠原纖維形態(tài)上呈現“橫紋帶或橫紋褶皺”，見箭頭所示。圖3艾瑞金膠原蛋白海綿200nm條件下透射電子顯微鏡圖片(×26500)Figure3TransmissionelectronmicroscoperesultofErigincollagenspongeat200nm(×26500)44

值，t檢驗結果顯示3組樣品吸光度值比較差異無顯著性意義(P>0.05)。依據測試結果，以標準品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標作圖，繪制標準曲線，其方程式為其方程式為y=0.152x+0.191(R2=0.97)，然后將樣品的吸光度值代入回歸方程，得到端N端肽濃度。從表4可看出，3個批次的去端肽Ⅰ型膠原蛋白均未檢出膠原N端肽，說明樣品中膠原N端肽濃度明顯低于試劑盒270kD180kD90kDγβα1α2圖4去端肽Ⅰ型膠原蛋白電泳圖譜Figure4ElectrophoresisoftypeIatelocollagen表1去端肽Ⅰ型膠原蛋白C端肽吸光度檢測結果Table1AbsorbancevalueofC-terminaltelopeptideintypeIatelocollagen組別吸光度值組別吸光度值組別吸光度值A10.045B11.208C10.120A20.044B20.795C20.099A32.886B30.712C30.081A42.850B40.429C40.095A52.399B50.424C50.106A62.421B60.129C60.109A71.222B70.095C70.108表注：A1、A2為空白對照孔檢測結果；A3-B5為標準品檢測結果；B6、B7、C1為批號20160503去端肽Ⅰ型膠原蛋白檢測結果；C2、C3、C4為批號20160419去端肽Ⅰ型膠原蛋白檢測結果；C5、C6、C7為批號20160513去端肽Ⅰ型膠原蛋白檢測結果。表2去端肽Ⅰ型膠原蛋白C端肽濃度檢測結果(nmol/L)Table2ConcentrationofC-terminaltelopeptideintypeIatelocollagen組別C端肽濃度組別C端肽濃度組別C端肽濃度A1-B131.37C1-A2-B218.76C2-A382.540B316.23C3-A481.45B47.61C4-A567.70B57.53C5-A668.35B6-C6-A731.78B7-C7-表注：A1、A2為空白對照孔檢測結果；A3-B5為標準品檢測結果；B6、B7、C1為批號201
【參考文獻】

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2 陸艷;單永強;邵安良;曾碧新;徐麗明;;ELISA抑制法檢測動物組織中α1,3-Gal抗原[J];藥物分析雜志;2015年10期

3 雷靜;李奕恒;劉旭昭;湯順清;;動物源Ⅰ型膠原蛋白可引起B(yǎng)ALB/c小鼠細胞免疫反應和組織免疫毒性[J];中國組織工程研究;2015年34期

4 單永強;徐麗明;柯林楠;陸艷;邵安良;章娜;曾碧新;;動物源性生物材料中殘留α-Gal抗原檢測方法[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2015年03期

5 張靜怡;吳文惠;王南平;何蘭;Elango JEEVITHAN;包斌;;羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原反應特性分析[J];食品科學;2015年07期

6 吳世福;劉成虎;侯麗;孫曉霞;蓋瀟瀟;施燕平;;膠原蛋白海綿浸提液對小鼠體外脾臟淋巴細胞轉化作用的研究[J];中國醫(yī)療器械雜志;2014年04期

7 徐麗明;邵安良;趙艷紅;;動物源性生物材料殘留DNA的定量檢測法[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2012年03期

8 史新立;劉傳玉;陳冰;;醫(yī)用膠原材料免疫原性的研究進展[J];中國醫(yī)藥;2010年10期

9 王秋卓;王彩虹;張文博;連霞;;可吸收性膠原止血海綿的制作工藝研究[J];中國醫(yī)藥導報;2010年17期

10 曹慧;許時嬰;;酶解工藝對Ⅱ型膠原蛋白分子結構及提取率的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2010年01期

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2 石服鑫;曹慧;徐斐;于勁松;;不同來源Ⅱ型膠原結構及其免疫活性[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2014年02期

3 尹玉霞;施燕平;侯麗;蓋瀟瀟;李海心;;某生物骨對小鼠體液免疫影響的研究[J];生物醫(yī)學工程研究;2013年03期

4 劉高梅;任海偉;王永剛;;豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白的制備及結構表征[J];食品研究與開發(fā);2012年08期

5 王秋卓;;論膠原蛋白對人類健康的特殊作用[J];價值工程;2012年05期

6 郭苗苗;浦金輝;徐丹;劉輝;;殼聚糖基快速止血材料的研究進展[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2012年01期

7 王秋卓;;膠原蛋白在健康美容方面的應用研究[J];價值工程;2011年29期

8 王秋卓;;牛跟腱制造海綿狀膠原蛋白纖維的技術研究[J];中國醫(yī)藥生物技術;2011年04期

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3 劉小芳;刺參營養(yǎng)成分的地域性差異分析及其磷脂的活性研究[D];中國海洋大學;2014年

4 肖楓;黃河鯉魚鱗膠原蛋白的性質及膠原肽活性研究[D];江蘇大學;2014年

5 王珊珊;鱈魚骨膠原肽與活性鈣的制備及其抗骨質疏松活性研究[D];中國海洋大學;2013年

6 倪賀;酵母來源血管緊張素轉移酶抑制多肽的制備及其抑制機理的研究[D];華南理工大學;2012年

7 徐杰;海參腦苷脂的分離純化、結構分析及其生物活性研究[D];中國海洋大學;2011年

8 侯虎;鱈魚免疫活性肽的可控制備及其免疫活性研究[D];中國海洋大學;2011年

9 金波昌;池塘養(yǎng)殖刺參（Apostichopus japonicus）食物來源的穩(wěn)定同位素法研究[D];中國海洋大學;2010年

10 閆鳴艷;狹鱈魚皮膠原蛋白結構和物理特性的研究[D];中國海洋大學;2009年

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【二級參考文獻】

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1 單永強;徐麗明;柯林楠;陸艷;邵安良;章娜;曾碧新;;動物源性生物材料中殘留α-Gal抗原檢測方法[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2015年03期

2 李素波;贠志敏;高紅偉;張雪;檀英霞;張士坤;季守平;宮鋒;;制備脆弱擬桿菌來源的新型α-半乳糖苷酶單抗用于檢測通用型紅細胞中的微量殘留酶[J];軍事醫(yī)學;2015年04期

3 贠志敏;張雪;李素波;檀英霞;冷泠;季守平;高紅偉;宮鋒;;α-半乳糖苷酶清除豬細胞表面的α-Gal抗原[J];生物技術通訊;2014年06期

4 李素波;高紅偉;張雪;鮑國強;檀英霞;王穎麗;季守平;宮鋒;;新型α-半乳糖苷酶多克隆抗體的制備及特異性鑒定[J];生物技術通訊;2013年06期

5 高紅偉;張雪;李素波;檀英霞;鮑國強;王穎麗;徐麗娟;季守平;宮鋒;;新型α-半乳糖苷酶清除動物紅細胞表面αGal抗原的研究[J];中國實驗血液學雜志;2012年05期

6 高紅偉;李素波;鮑國強;檀英霞;王玲燕;金泗虎;王穎麗;季守平;宮鋒;;原核基因工程制備新型重組α-半乳糖苷酶應用于人B→O血型改造的研究[J];中國實驗血液學雜志;2011年02期

7 范晶;吳丹;郭亞芬;蘭干球;蔣欽楊;陳江偉;阮志華;王愛德;;三個品種豬α-Gal抗原表位的免疫組化分析[J];實用預防醫(yī)學;2010年10期

8 李德娟;何巍;張睿;付琳娜;趙麗劍;王宇;金立杰;;氫氧化鋁佐劑配制工藝的優(yōu)化[J];中國生物制品學雜志;2010年10期

9 田寶祥;樊華;劉鳳彬;魏純琳;;組織工程皮膚的生物學特性及其臨床應用評價[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年02期

10 李秋澤;徐志云;黃盛東;張寶仁;楊立信;劉曉紅;袁揚;龔德軍;;豬去細胞心臟瓣膜的免疫原性[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年38期

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5 王寧;張艷;張珉;黃濤;;縫隙連接蛋白43對成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白的調節(jié)作用[J];中國老年學雜志;2019年10期

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8 章明星;侯致典;周星星;廖華;王齊;余磊;丁自海;;PDGF-BB、IL-13和TGF-β1誘導真皮成纖維細分泌Ⅰ型膠原蛋白的比較[J];解剖學研究;2009年05期

9 李靈芝,張永亮,馮凱琳,劉建中;Ⅰ型膠原在胎鼠骺板的表達及其與雌激素的關系[J];第三軍醫(yī)大學學報;2000年12期

10 買霞;陳莉;扎拉嘎胡;陳小義;王英慧;;bFGF通過上調Ras/ERK信號通路誘導BMSCs表達Ⅰ型膠原[J];中國藥理學通報;2011年03期

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