FAH基因敲除克隆小型豬的制備及繁育
發(fā)布時間：2020-12-18 22:40
目的供體的短缺是器官移植所面臨的主要問題,制備人源化器官是解決此問題的有效途徑之一。缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）會引起遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型（hereditary tyrosinemia typeⅠ, HTⅠ）,致使患者肝細(xì)胞凋亡,呈現(xiàn)出肝損傷。對豬（Sus scrofa）進(jìn)行基因編輯,建立FAH基因敲除巴馬小型豬,結(jié)合人干細(xì)胞將有利于人源化干細(xì)胞肝的制備。本研究在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1）敲除巴馬小型豬的基礎(chǔ)上,通過CRISPR/Cas9技術(shù)制備FAH基因敲除(FAH+/-、FAH-/-)小型豬,并分析其健康與繁育狀況。方法針對豬FAH基因設(shè)計單鏈導(dǎo)向RNA （single guide RNA, sgRNA）構(gòu)建pX330表達(dá)載體轉(zhuǎn)染巴馬小型豬耳成纖維細(xì)胞（ear fibroblasts of Bama minipigs, BMEF）并進(jìn)行敲除效率驗證,鑒定后選擇陽性細(xì)胞作為核供體,通過體細(xì)胞核移植...
【文章來源】：中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 2019年05期 北大核心
【文章頁數(shù)】：9 頁
【文章目錄】：
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物
1.1.2 細(xì)胞系
1.1.3 質(zhì)粒
1.2 主要試劑與儀器
1.3 實驗方法
1.3.1 打靶載體構(gòu)建
1.3.2 轉(zhuǎn)染
1.3.3 sgRNA敲除效率檢測
1.3.4 單細(xì)胞克隆的獲得及鑒定
1.3.5 FAH基因敲除克隆豬的制備及鑒定
1.3.6 仔豬血常規(guī)及血生化檢測
1.3.7 組織學(xué)切片觀察
1.3.8 Western blot檢測
1.3.9 FAH+/-豬繁育能力及統(tǒng)計學(xué)分析
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法
2 結(jié)果
2.1 打靶載體構(gòu)建及效率檢測
2.2 單細(xì)胞克隆突變類型的鑒定
2.3 FAH基因敲除豬的制備與鑒定
2.4 仔豬血液檢測
2.5 組織學(xué)切片觀察
2.6 Western blot檢測
2.7 FAH+/-豬繁育能力分析
3 討論
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導(dǎo)CMAH基因敲除豬創(chuàng)制及繁育分析[J]. 黃林華,李西睿,龍川,石寧寧,馮沖,杜敏杰,朱輝斌,潘登科,孫秀柱. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2018(06)
[2]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的β4GalNT2基因敲除豬制備[J]. 唐雨婷,高景波,龍川,杜敏杰,黃林華,潘登科,杜曉華. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2017(10)
[3]Highly efficient generation of GGTA1 knockout pigs using a combination of TALEN m RNA and magnetic beads with somatic cell nuclear transfer[J]. FENG Chong,LI Xi-rui,CUI Hui-ting,LONG Chuan,LIU Xia,TIAN Xing-hua,PAN Deng-ke,LUO Yu-zhu. Journal of Integrative Agriculture. 2016(07)
[4]干細(xì)胞移植治療肝功能衰竭的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]. 吳貽琛,萬志紅,辛紹杰. 肝臟. 2015(03)
[5]檸檬百里香葉揮發(fā)油成分分析及對肝癌細(xì)胞毒性作用[J]. 吳爽,魏鳳香,李紅枝,劉小廣,張建華,劉君星. 中藥材. 2013(05)
[6]利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J]. 鄭道山,馮沖,朱彥賓,龍川,馮書堂,潘登科,馬文麗. 生物技術(shù)通訊. 2011(04)
[7]新型生物人工肝系統(tǒng)治療急性肝衰竭犬后豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒傳播的實驗研究[J]. 陳鐘,陳瑞新,丁義濤,田鵬鵬,周卉. 南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2007(03)
碩士論文
[1]人肝源性干細(xì)胞在Fah-/-Rag2-/-小鼠中生物學(xué)行為的研究[D]. 劉芳遐.第二軍醫(yī)大學(xué) 2010
本文編號：2924726
【文章來源】：中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 2019年05期 北大核心
【文章頁數(shù)】：9 頁
【文章目錄】：
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物
1.1.2 細(xì)胞系
1.1.3 質(zhì)粒
1.2 主要試劑與儀器
1.3 實驗方法
1.3.1 打靶載體構(gòu)建
1.3.2 轉(zhuǎn)染
1.3.3 sgRNA敲除效率檢測
1.3.4 單細(xì)胞克隆的獲得及鑒定
1.3.5 FAH基因敲除克隆豬的制備及鑒定
1.3.6 仔豬血常規(guī)及血生化檢測
1.3.7 組織學(xué)切片觀察
1.3.8 Western blot檢測
1.3.9 FAH+/-豬繁育能力及統(tǒng)計學(xué)分析
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法
2 結(jié)果
2.1 打靶載體構(gòu)建及效率檢測
2.2 單細(xì)胞克隆突變類型的鑒定
2.3 FAH基因敲除豬的制備與鑒定
2.4 仔豬血液檢測
2.5 組織學(xué)切片觀察
2.6 Western blot檢測
2.7 FAH+/-豬繁育能力分析
3 討論
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導(dǎo)CMAH基因敲除豬創(chuàng)制及繁育分析[J]. 黃林華,李西睿,龍川,石寧寧,馮沖,杜敏杰,朱輝斌,潘登科,孫秀柱. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2018(06)
[2]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的β4GalNT2基因敲除豬制備[J]. 唐雨婷,高景波,龍川,杜敏杰,黃林華,潘登科,杜曉華. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2017(10)
[3]Highly efficient generation of GGTA1 knockout pigs using a combination of TALEN m RNA and magnetic beads with somatic cell nuclear transfer[J]. FENG Chong,LI Xi-rui,CUI Hui-ting,LONG Chuan,LIU Xia,TIAN Xing-hua,PAN Deng-ke,LUO Yu-zhu. Journal of Integrative Agriculture. 2016(07)
[4]干細(xì)胞移植治療肝功能衰竭的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]. 吳貽琛,萬志紅,辛紹杰. 肝臟. 2015(03)
[5]檸檬百里香葉揮發(fā)油成分分析及對肝癌細(xì)胞毒性作用[J]. 吳爽,魏鳳香,李紅枝,劉小廣,張建華,劉君星. 中藥材. 2013(05)
[6]利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J]. 鄭道山,馮沖,朱彥賓,龍川,馮書堂,潘登科,馬文麗. 生物技術(shù)通訊. 2011(04)
[7]新型生物人工肝系統(tǒng)治療急性肝衰竭犬后豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒傳播的實驗研究[J]. 陳鐘,陳瑞新,丁義濤,田鵬鵬,周卉. 南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2007(03)
碩士論文
[1]人肝源性干細(xì)胞在Fah-/-Rag2-/-小鼠中生物學(xué)行為的研究[D]. 劉芳遐.第二軍醫(yī)大學(xué) 2010
本文編號：2924726
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