發(fā)布時(shí)間：2025-06-20 00:41

　　 背景:軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程最常用的種子細(xì)胞,但是如何在體外擴(kuò)增的同時(shí)又能維持其良好的軟骨表型是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目的:通過(guò)微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法,明確三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)對(duì)耳郭軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響,為建立規(guī)模化擴(kuò)增方法提供技術(shù)參考。方法:應(yīng)用胰酶、膠原酶消化法分離、培養(yǎng)豬耳軟骨細(xì)胞,并將獲得的軟骨細(xì)胞分為3組:培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)、微載體三維靜止培養(yǎng)和微載體三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。應(yīng)用掃描電鏡、熒光倒置顯微鏡、DIO熒光染色、冰凍切片DAPI染色觀察細(xì)胞在微球上生長(zhǎng)情況,DNA定量檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖能力,Real-time PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)基因表達(dá)差異。結(jié)果與結(jié)論:①第1代軟骨細(xì)胞可快速貼附于CultispherG多孔微載體表面,微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量多于微載體靜止培養(yǎng)組,而且微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞分布更為均勻;②培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)時(shí),軟骨細(xì)胞在4d時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期,微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)為2-10 d,細(xì)胞數(shù)量在14 d達(dá)到高峰,微載體靜止培養(yǎng)組細(xì)胞增殖速度緩慢;③在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)中,二維培養(yǎng)和微載體靜止培養(yǎng)軟骨表型喪失,而微載體三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí),能夠維持軟骨表型;④結(jié)果表明,微載...

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圖4三種培養(yǎng)方法軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)量單層培養(yǎng)組0.40.201.00.500.151.00.80.050.040.030.020.01P<0.05ACAN相對(duì)表COL2相對(duì)表達(dá)(×SOX9相對(duì)表達(dá)(表達(dá)

7.3倍，微載體靜止培養(yǎng)組細(xì)胞總量增加約2.2倍。在培養(yǎng)第14天，微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外2組(P<0.001)，培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)組高于微載體靜止培養(yǎng)組(P<0.05)。2.3軟骨細(xì)胞表型相關(guān)基因表達(dá)各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21d時(shí)，軟骨基質(zhì)特異性基因ACAN和COL2相對(duì)表達(dá)....

圖4三種培養(yǎng)方法軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)量1.00.50SOX9相對(duì)表達(dá)(

7.3倍，微載體靜止培養(yǎng)組細(xì)胞總量增加約2.2倍。在培養(yǎng)第14天，微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量顯著高于另外2組(P<0.001)，培養(yǎng)皿單層培養(yǎng)組高于微載體靜止培養(yǎng)組(P<0.05)。2.3軟骨細(xì)胞表型相關(guān)基因表達(dá)各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21d時(shí)，軟骨基質(zhì)特異性基因ACAN和COL2相對(duì)表達(dá)....

圖2微球靜止培養(yǎng)組和微球動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組培養(yǎng)21d時(shí)倒置顯微鏡、掃描電鏡、DIO熒光、冰凍切片DAPI染色結(jié)果Figure2Resultsofinvertedmicroscope,electronmicroscope,DAPI染色μm200μm200

d時(shí)，軟骨基質(zhì)特異性基因ACAN和COL2相對(duì)表達(dá)量在微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組表達(dá)最高，與其他2組比較差異有顯著性意義。SOX9基因相對(duì)表達(dá)量在3組之間差異無(wú)顯著性意義。COMP基因相對(duì)表達(dá)量在微載體動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組和微載體靜止培養(yǎng)組之間差異有顯著性意義，見(jiàn)圖4�！�4×10第1代第6代圖注：第....

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