發(fā)布時間：2018-03-12 13:11

  本文選題：雌激素　切入點：C型鈉肽　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂在胎兒時期的原始卵泡內(nèi)就已經(jīng)啟動,隨后阻滯在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期,被阻滯在雙線期的初級卵母細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)形成生發(fā)泡(germinal vesicle,GV),所以這一時期的卵母細(xì)胞也稱為生發(fā)泡期卵母細(xì)胞。C型鈉肽(C-type natriuretic peptide,CNP)為鈉尿肽家族成員之一。最近的研究發(fā)現(xiàn),CNP是小鼠卵泡中天然存在的、能夠維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵物質(zhì),由壁顆粒細(xì)胞生成,而其受體NPR2(natriuretic peptide receptor 2,NPR2)由卵丘細(xì)胞產(chǎn)生。研究表明,卵母細(xì)胞旁分泌因子(oocyte-derived paracrine factors,ODPFs)、17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)、促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH)分別通過調(diào)控CNP或NPR2的表達(dá)而參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中,添加不同濃度(0.27ng/mL、1.35 ng/mL、13.5ng/mL、1μg/mL和2μg/mL)的雌激素(17β-E2)對CNP介導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的作用表現(xiàn)不同,我們推測這可能是由于不同濃度雌激素通過不同的雌激素受體通路發(fā)揮調(diào)控作用。研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.利用Hochest33342染色方法觀察體外培養(yǎng)6 h時,統(tǒng)計不同雌激素濃度組GV期卵母細(xì)胞百分率,分析不同濃度雌激素對CNP誘導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的影響。結(jié)果表明,低濃度雌激素促進(jìn)了CNP對山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的維持作用;而高濃度雌激素則降低了CNP對山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的維持作用,促進(jìn)了卵母細(xì)胞的核成熟。2.在上述試驗基礎(chǔ)上,利用不同雌激素受體的抑制劑或激活劑來探討高濃度或低濃度雌激素通過何種受體通路介導(dǎo)CNP誘導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。高濃度雌激素(1μg/mL17β-E2)試驗結(jié)果表明,雌激素膜受體抑制劑G15的添加使培養(yǎng)后GV期卵母細(xì)胞比率顯著升高,與單獨添加CNP組無顯著差異(P0.05);而雌激素核受體抑制劑ICI182780的添加并沒有影響高濃度雌激素的作用;膜受體激活劑G1的添加,證明了高濃度雌激素通過膜受體GPR30降低了CNP對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的維持作用。低濃度雌激素(0.27 ng/mL17β-E2)試驗結(jié)果表明,G15的添加并沒有阻斷低濃度雌激素對CNP誘導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯維持作用的升高,而ICI182780卻阻斷了雌激素的這種作用。證明,低濃度雌激素通過核受體ERα、ERβ促進(jìn)CNP對山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的維持作用。3.高濃度或低濃度雌激素對CNP介導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的作用有可能是通過調(diào)控Npr2 mRNA的表達(dá)而發(fā)揮作用的。COCs體外培養(yǎng)2 h時,高濃度雌激素降低了COCs中Npr2 mRNA的表達(dá)水平,而低濃度雌激素升高了Npr2 mRNA的表達(dá)水平;培養(yǎng)4 h和6 h時,與同時間段僅添加CNP的對照組相比,高濃度或低濃度雌激素都升高了Npr2 mRNA的表達(dá)水平。但是無論是高濃度還是低濃度雌激素的添加,隨著培養(yǎng)時間的延長,對Npr2 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用都是減弱的;培養(yǎng)4 h和6 h時,由于低濃度雌激素的添加,能夠維持Npr2 mRNA表達(dá)在一個較高水平,而且與培養(yǎng)2 h時CNP組無顯著差異(P0.05),說明低濃度雌激素可以在一定時間內(nèi)維持體外培養(yǎng)的COCs中Npr2mRNA的表達(dá)。4.利用不同的雌激素受體抑制劑或激活劑,進(jìn)一步探討COCs培養(yǎng)2 h時高濃度雌激素對Npr2 mRNA表達(dá)的調(diào)控。結(jié)果表明,G15阻礙了高濃度雌激素對Npr2 mRNA的下調(diào)作用,而ICI182780并不表現(xiàn)此作用;G1的添加起到了與高濃度雌激素添加類似的、下調(diào)Npr2 mRNA表達(dá)的作用,進(jìn)一步證明高濃度雌激素通過GPR30下調(diào)Npr2m RNA表達(dá)。5.將山羊COCs分別在添加CNP、CNP+E2(0.27 ng/mL)和CNP+E2(1μg/mL)的體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h,后轉(zhuǎn)入常規(guī)成熟培養(yǎng)液培養(yǎng)18 h,統(tǒng)計卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵母細(xì)胞成熟情況。結(jié)果表明,CNP組和CNP+E2(0.27 ng/mL)組卵母細(xì)胞成熟率分別為70.00±5.93%和73.73±6.28%(P0.05);CNP+E2(1μg/mL)組為52.83±8.11%,顯著低于CNP組和CNP+E2(0.27 ng/mL)組(P0.05)。兩步法體外成熟培養(yǎng)山羊COCs后,卵丘細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的擴(kuò)展,三個培養(yǎng)組卵丘細(xì)胞0級、Ⅰ級和Ⅲ級擴(kuò)展的COCs比例差異不顯著(P0.05);CNP和CNP+E2(0.27 ng/mL)組卵丘細(xì)胞Ⅱ級擴(kuò)展的數(shù)目顯著高于CNP+E2(1μg/mL)組(P0.05),而Ⅳ級擴(kuò)展比例則為CNP+E2(1μg/mL)組顯著高于CNP組和CNP+E2(0.27 ng/mL)組(P0.05)。綜上所述,卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中雌激素濃度對CNP誘導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的作用不同。高濃度雌激素通過膜受體GPR30降低了CNP對山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的維持作用;而低濃度雌激素通過核受體ERα、ERβ促進(jìn)了CNP對山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的維持作用。高濃度雌激素對CNP介導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯作用的減弱,是通過膜受體GPR30通路下調(diào)Npr2 mRNA表達(dá)來發(fā)揮作用的;而低濃度雌激素對CNP介導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯作用的促進(jìn),是通過上調(diào)Npr2mRNA的表達(dá)來發(fā)揮作用的。兩步法體外培養(yǎng)山羊COCs成熟后,高濃度雌激素顯著促進(jìn)了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散,但是卻降低了卵母細(xì)胞成熟率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827

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本文編號：1601701