發(fā)布時(shí)間：2025-03-18 06:44

　　早期斷奶引起的仔豬早期斷奶應(yīng)激綜合癥是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的大事件，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。早期斷奶給仔豬造成的最明顯損傷就是導(dǎo)致仔豬腸道屏障功能損傷。有研究證實(shí),細(xì)胞凋亡紊亂會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙和胃腸功能損傷，而自由基代謝異常與凋亡紊亂密切相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，早期斷奶會(huì)導(dǎo)致仔豬血清中H2O2和NO含量增加、抗氧化能力降低。但是斷奶導(dǎo)致的仔豬自由基代謝異常與腸細(xì)胞凋亡及腸屏障功能之間的關(guān)系仍未可知。 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC），作為一種強(qiáng)有效的抗氧化劑，已廣泛應(yīng)用于臨床疾病治療研究，但對(duì)于其能否調(diào)控?cái)嗄虘?yīng)激仔豬的自由基代謝和腸道細(xì)胞凋亡過程，減少腸道屏障損傷，緩解斷奶應(yīng)激綜合癥及其機(jī)理還未見報(bào)道，為此，本文開展以下四個(gè)研究 1早期斷奶過程中仔豬腸道細(xì)胞凋亡研究 以酶學(xué)ELISA法分析Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性，利用原位缺口末端標(biāo)記、透射電鏡法觀察腸組織形態(tài)變化，并對(duì)凋亡相關(guān)基因（Caspase-3、8、9、Bcl-2和Bax基因）進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析，研究21日齡斷奶仔豬腸道細(xì)胞的凋亡過程，探...

【文章頁數(shù)】：174 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
    1 細(xì)胞凋亡與腸道功能
        1.1 細(xì)胞凋亡的概念
        1.2 細(xì)胞凋亡機(jī)制
            1.2.1 半胱氨酸蛋白酶的激活與特性
            1.2.2 線粒體途徑
            1.2.3 死亡受體途徑
            1.2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑
        1.3 細(xì)胞凋亡與腸道功能的關(guān)系
            1.3.1 細(xì)胞凋亡與炎性腸病
            1.3.2 細(xì)胞凋亡與腸道癌癥
            1.3.3 細(xì)胞凋亡與缺血再灌注
    2 氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡
        2.1 氧化應(yīng)激和自由基
            2.1.1 線粒體：細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生的重要場所
            2.1.2 ROS 和氧化損傷
            2.1.3 線粒體：ROS 作用的靶點(diǎn)
        2.2 ROS 和細(xì)胞凋亡
            2.2.1 ROS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制
            2.2.2 ROS 和細(xì)胞色素 C 釋放機(jī)制
            2.2.3 心磷脂過氧化調(diào)控細(xì)胞色素 C 的釋放
        2.3 細(xì)胞 ROS、氧化還原和抗氧化防御系統(tǒng)
            2.3.1 抗氧化防御系統(tǒng)
            2.3.2 線粒體抗氧化防御系統(tǒng)
    3 腸道抗氧化生物學(xué)
        3.1 腸上皮的結(jié)構(gòu)與功能
        3.2 小腸細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和抗氧化防御體系
            3.2.1 細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的概念
            3.2.2 谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶系統(tǒng) (GSH/GSSG)
            3.2.3 硫氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)（Trx/TrxSS）
            3.2.4 半胱氨酸氧化還原系統(tǒng)(Cys/CySS)
        3.3 腸道氧化應(yīng)激與腸道病理學(xué)
            3.3.1 腸道氧化應(yīng)激與細(xì)胞的命運(yùn)：增殖、分化、凋亡
            3.3.2 氧化應(yīng)激、氧化還原狀態(tài)與腸道疾病
    4 氧化應(yīng)激與抗氧化治療
        4.1 抗氧化治療與腸道疾病
        4.2 N-乙酰半胱氨酸——GSH 的前體物質(zhì)
        4.3 早期斷奶應(yīng)激綜合癥
第一章 仔豬早期斷奶過程中腸道細(xì)胞凋亡研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
        1.2 腸組織 DNA Ladder 檢測
            1.2.1 試劑及儀器
            1.2.2 腸黏膜 DNA 提取
            1.2.3 電泳
        1.3 空腸組織中凋亡酶含量的測定
            1.3.1 試劑及儀器
            1.3.2 腸道組織勻漿中蛋白含量的測定
            1.3.3 Caspase-3 ELISA 檢測
            1.3.4 Caspase-8 ELISA 檢測
            1.3.5 Caspase-9 ELISA 檢測
        1.4 空腸腸組織 TUNEL 檢測
            1.4.1 實(shí)驗(yàn)原理
            1.4.2 試劑
            1.4.3 設(shè)備
            1.4.4 組織包埋程序
            1.4.5 組織石蠟切片的制作
            1.4.6 腸組織 TUNEL 檢測
        1.5 腸細(xì)胞透射電鏡觀察
            1.5.1 原理
            1.5.2 試劑材料
            1.5.3 操作步驟
        1.6 腸組織凋亡相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 檢測
            1.6.1 試劑及儀器
            1.6.2 總 RNA 的提取
            1.6.3 凋亡相關(guān)基因熒光定量 PCR
    2 結(jié)果與分析
        2.1 腸組織 DNA Ladder 檢測
        2.2 早期斷奶對(duì)仔豬空腸組織中凋亡酶含量的影響
        2.3 早期斷奶對(duì)仔豬空腸腸細(xì)胞凋亡的影響
        2.4 透射電鏡檢測早期斷奶對(duì)仔豬空腸腸細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
        2.5 凋亡相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 檢測
    3 討論
        3.1 斷奶后仔豬腸細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
        3.2 斷奶后仔豬腸細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究
    4 小結(jié)
第二章 早期斷奶仔豬自由基代謝與腸細(xì)胞凋亡及腸屏障功能的關(guān)系
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
            1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
            1.1.2 試驗(yàn)藥品
            1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
        1.2 血清抗氧化指標(biāo)的測定
            1.2.1 血清中微量 MDA 含量的檢測方法
            1.2.2 血清中 SOD 活力的檢測方法
            1.2.3 血清中 GSH-Px 活力的檢測
            1.2.4 血清中 NO 含量測定
            1.2.5 血清中 H2O2的測定
            1.2.6 血清抑制羥自由基能力檢測
        1.3 酶聯(lián)免疫法檢測血清皮質(zhì)醇、低氧誘導(dǎo)因子及 TNF-α含量
            1.3.1 皮質(zhì)醇
            1.3.2 低氧誘導(dǎo)因子
            1.3.3 腫瘤壞死因子α
        1.4 腸黏膜通透性檢測
            1.4.1 血清 DAO 含量測定
            1.4.2 血清 IFABP 含量測定
        1.5 緊密連接相關(guān)基因熒光定量 PCR 檢測
            1.5.1 引物設(shè)計(jì)
            1.5.2 腸組織總 RNA 提取
            1.5.3 緊密連接相關(guān)基因熒光定量 PCR 檢測
        1.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 血清皮質(zhì)醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        2.2 血清 DAO 和 IFABP 測定
        2.3 血清抗氧化指標(biāo)及自由基含量測定
        2.4 緊密連接相關(guān)基因熒光定量 PCR 檢測
        2.5 凋亡酶含量與抗氧化指標(biāo)和自由基含量的相關(guān)性分析
    3 討論
        3.1 早期斷奶對(duì)仔豬血清皮質(zhì)醇、HIF-1α和 TNF-α含量的影響
        3.2 早期斷奶對(duì)仔豬血清 DAO 和 IFABP 含量的影響
        3.3 早期斷奶對(duì)仔豬血清抗氧化狀態(tài)的影響
        3.4 早期斷奶對(duì)仔豬腸黏膜緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
    4 小結(jié)
第三章 斷奶仔豬小腸基因表達(dá)譜及細(xì)胞凋亡代謝網(wǎng)絡(luò)分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料：
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
            1.1.2 試劑及儀器
        1.2 RNA 抽提和純化
        1.3 芯片實(shí)驗(yàn)
            1.3.1 樣品 RNA 的放大和標(biāo)記
            1.3.2 芯片雜交
            1.3.3 芯片掃描
            1.3.4 芯片數(shù)據(jù)分析
        1.4 細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因熒光定量 PCR 驗(yàn)證
            1.4.1 引物設(shè)計(jì)
            1.4.2 熒光定量 PCR 檢測
            1.4.3 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 RNA 樣品質(zhì)控
        2.2 芯片實(shí)驗(yàn)質(zhì)控
            2.2.1 芯片檢出率檢測
            2.2.2 雜交信號(hào)均一性檢測
            2.2.3 芯片雜交火山圖
            2.2.4 芯片雜交箱線圖
            2.2.5 芯片雜交 PCA 圖分析
        2.3 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果
        2.4 差異表達(dá)基因 heatmap 圖
        2.5 差異表達(dá)基因 GO 聚類分析
        2.6 差異表達(dá)基因 KEGG 代謝途徑分析
        2.7 細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 驗(yàn)證
        2.8 斷奶仔豬主要代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
        2.9 細(xì)胞周期代謝圖繪制
        2.10 免疫調(diào)控代謝圖繪制
    3. 討論
        3.1 斷奶后仔豬腸組織差異表達(dá)基因的篩選
        3.2 斷奶后仔豬腸細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞周期調(diào)控間的關(guān)系
        3.3 斷奶后仔豬腸 MAPK、JAK-STAT 途徑與細(xì)胞周期調(diào)控
    4 小結(jié)
第四章 N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)仔豬斷奶應(yīng)激和腸道細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)理
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料：
            1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
            1.1.2 試驗(yàn)儀器
        1.2 血清皮質(zhì)醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        1.3 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)測定
            1.3.1 血清和肝臟 SOD 測定
            1.3.2 血清和肝臟 GSH-PX 活力測定
            1.3.3 血清和肝臟 MDA 含量測定
        1.4 空腸組織 HE 染色
            1.4.1 常規(guī)石蠟切片制作
            1.4.2 常規(guī)蘇木精-伊紅染色
        1.5 空腸組織 TUNEL 染色
        1.6 空腸組織透射電鏡檢測
        1.7 凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)基因 mRNA 表達(dá)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 血清皮質(zhì)醇、TNF-α和 HIF-1α含量
        2.2 早期斷奶對(duì)仔豬血清和肝臟組織抗氧化能力的影響
        2.3 早期斷奶對(duì)仔豬空腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響
        2.4 腸組織 TUNEL 檢測
        2.5 腸細(xì)胞透射電鏡觀察
        2.6 細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 檢測
    3 討論
        3.1 NAC 對(duì)斷奶仔豬抗氧化能力及應(yīng)激狀態(tài)的影響
        3.2 NAC 對(duì)斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控
    4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
文章部分縮略詞表
本文創(chuàng)新點(diǎn)及有待解決的問題
致謝
攻讀博士期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：4036165