發(fā)布時間：2020-11-16 01:38

【摘要】：目的支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是嚴重威脅早產兒尤其極早早產兒的一種常見肺部疾病。前期研究發(fā)現,在高氧誘導的BPD中,肺泡Ⅱ型上皮細胞(type II alveolar epithelial cells,AECⅡs)凋亡增加,且通過內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導的CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)凋亡途徑活化。但CHOP表達改變對高氧暴露后AECⅡs凋亡是否產生影響,目前尚不清楚。本研究主要通過檢測被CHOP-siRNA轉染的AECⅡs細胞株在高氧暴露后CHOP、Bcl-2和Bax的表達水平以及AECⅡs凋亡情況,探討阻斷內源性CHOP表達對高氧暴露AECⅡs凋亡的影響。方法體外設計合成靶向CHOP基因的siRNA堿基序列,采用Lipofectamine2000脂質體介導法對AECⅡs細胞進行pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA及pcDNA3.1(+)-空質粒瞬時轉染,RT-PCR和Western blot檢測siRNA干擾后CHOP基因沉默效果。轉染后24 h給予高氧暴露,將細胞分為空氣組、空氣+pcDNA3.1(+)-空質粒組、空氣+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組、高氧組、高氧+pcDNA3.1(+)-空質粒組、高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),于空氣或高氧暴露48 h收集各組細胞,Annexin V/PI雙染法及流式儀檢測早期細胞凋亡,RT-PCR及Western blot檢測CHOP、Bcl-2及Bax表達水平。結果(1)空氣組AECⅡs伸出較多偽足,緊貼于瓶底,呈島狀生長方式,空氣+pcDNA3.1(+)-空質粒組及空氣+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組細胞形態(tài)與空氣組相比無明顯差異;高氧組AECⅡs伸展肥大明顯,細胞貼壁不緊,偽足減少,核仁減少或消失,培養(yǎng)液中懸浮細胞數增加,少數細胞出現空泡改變,高氧+pcDNA3.1(+)-空質粒組與高氧組相比無明顯差異;高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組細胞形態(tài)較空氣組稍有伸展肥大,但較高氧組細胞伸展程度變小,懸浮細胞數減少,且細胞無空泡改變。(2)與空氣組相比,高氧組AECⅡs凋亡明顯增加,CHOP基因mRNA及蛋白表達增加,Bcl-2基因mRNA及蛋白減少,Bax基因mRNA及蛋白表達增加。(3)AECⅡs轉染CHOP-siRNA后,與高氧組相比,高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA組AECⅡs凋亡減少,CHOP基因mRNA及蛋白表達減少,Bcl-2基因mRNA及蛋白表達增加,Bax基因mRNA及蛋白表達減少。結論(1)高氧可導致AECⅡs凋亡增加,CHOP表達增加,抗凋亡基因Bcl-2減少,促凋亡基因Bax增加,提示高表達的CHOP可通過下調抗凋亡基因Bcl-2表達及促進促凋亡基因Bax的表達,最終導致細胞凋亡增加。(2)AECⅡs轉染CHOP-siRNA阻斷CHOP表達后,可減輕高氧誘導的AECⅡs凋亡。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R722.6
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞
第一章 前言
    1.1 研究背景
    1.2 主要研究內容、目標及意義和技術路線
        1.2.1 主要研究內容
        1.2.2 主要研究目標
        1.2.3 主要研究意義
        1.2.4 技術路線
第二章 siRNA沉默CHOP基因對高氧暴露AECⅡs凋亡的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗用細胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要試劑的配制
        2.1.4 主要設備和器材
    2.2 實驗方法
        2.2.1 AECⅡs培養(yǎng)
        2.2.2 pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA及pcDNA3.1（+）-空質粒瞬時轉染
        2.2.3 pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA瞬時轉染效果檢測
        2.2.4 高氧細胞損傷建立及分組
        2.2.5 倒置相差顯微鏡觀察AECⅡs形態(tài)
        2.2.6 RT-PCR檢測各組細胞CHOP、Bcl-2及BaxmRNA表達
        2.2.7 Western blot檢測各組細胞CHOP、Bcl-2及Bax蛋白表達
        2.2.8 AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測各組細胞凋亡
    2.3 統(tǒng)計學分析
    2.4 實驗結果
        2.4.1 pcDNA3.1（+）-空質粒及pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA轉染結果
        2.4.2 倒置相差顯微鏡觀察AECⅡs形態(tài)
        2.4.3 CHOP-siRNA對CHOP基因mRNA及蛋白表達的影響
        2.4.4 CHOP-siRNA對Bcl-2基因mRNA及蛋白表達的影響
        2.4.5 CHOP-siRNA對Bax基因mRNA及蛋白表達的影響
        2.4.6 流式細胞術檢測CHOP沉默對細胞早期凋亡的影響
    2.5 討論
第三章 結論
參考文獻
綜述 肺泡上皮細胞凋亡介導肺損傷的研究進展
    參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的論文

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本文編號：2885465