發(fā)布時(shí)間：2024-10-05 00:12

　　目的旨在克服現(xiàn)有抗原篩選方法的不足,構(gòu)建我國(guó)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）臨床分離株XN-1的全基因組文庫(kù),從中篩選PA疫苗的候選抗原,為防控PA感染打下基礎(chǔ)。方法1.全基因組文庫(kù)的構(gòu)建:提取PA XN-1全基因組DNA,內(nèi)切酶Sau3A I酶切DNA,內(nèi)切酶BamH I酶切的載體pMal-c5x。通過(guò)連接酶將其與隨機(jī)基因組片段連接,構(gòu)建隨機(jī)重組子質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化隨機(jī)重組子至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞X-Blue中。挑選出隨機(jī)重組子克隆,通過(guò)PCR反應(yīng)和酶切鑒定等方法,對(duì)隨機(jī)重組子進(jìn)行初步鑒定,評(píng)價(jià)插入基因組片段的特點(diǎn)。IPTG誘導(dǎo)溶菌酶上清液的陽(yáng)性重組子的MBP融合蛋白表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)其表達(dá)情況,從而構(gòu)建PA XN-1全基因組文庫(kù)。2.PA候選抗原的篩選及保護(hù)效果評(píng)價(jià):為了進(jìn)一步從隨機(jī)重組子文庫(kù)中篩選到PA疫苗候選抗原,本研究制備了抗MBP多克隆抗體,將其包被于ELISA板上,以捕獲隨機(jī)重組子表達(dá)的MBP融合蛋白。以PA感染患者恢復(fù)期血清作為一抗,檢測(cè)隨機(jī)重組子攜帶的未知抗原的反應(yīng)性。測(cè)定強(qiáng)反應(yīng)性抗原的編碼序列,通過(guò)BLAST序列比對(duì),獲得強(qiáng)反應(yīng)性抗原的...

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1-1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1-1-1所示，提取PAXN-1全基因組DNA，使用內(nèi)切酶Sau3AI酶切，回收100-1000bp大小的隨機(jī)基因組片段，與經(jīng)內(nèi)切酶BamHI酶切后的載體pMal-c5x連接，構(gòu)建隨機(jī)重組子質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化....

圖1-1-2PAXN-1基因組與pMAL-c5x載體的電泳檢測(cè)Fig.1-1-2ElectrophoresisofgenomeofPAXN-1andPmal-c5xvectors

圖1-1-2PAXN-1基因組與pMAL-c5x載體的電泳檢測(cè)1-1-2ElectrophoresisofgenomeofPAXN-1andPmal-c5xvectorsMarker,1.undigestedPAXN-1genome,2.....

圖1-1-3隨機(jī)重組子的BamHI酶切鑒定Fig.1-1-3IdentificationofrecombinantplasmidsbyBamHIdigestion

圖1-1-3隨機(jī)重組子的BamHI酶切鑒定Fig.1-1-3IdentificationofrecombinantplasmidsbyBamHIdigestionMarker,Lane1,3,5.undigestedrecombinant....

圖1-1-4PCR檢測(cè)插入片段的隨機(jī)性Fig1-1-4Randomnessofinsertedsegments

圖1-1-4PCR檢測(cè)插入片段的隨機(jī)性Fig1-1-4RandomnessofinsertedsegmentsM.DNAMarker,1.Sample1.7,2.Sample1.8,3.Sample1.22,4.Sample1.26,5....

本文編號(hào)：4007311