鋅轉運體Zip7對線粒體自噬的調(diào)控作用及分子機制研究
發(fā)布時間：2025-02-06 16:46
目的1.觀察再灌注時Zip7達上調(diào)是否通過抑制心肌細胞線粒體自噬來增加線粒體ROS的產(chǎn)生。2.探討Zip7調(diào)控線粒體自噬的分子機制。方法用大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型和H9c2細胞缺氧/復氧模型,檢測再灌注及復氧期Zip7的表達變化情況;構建Zip7敲除的雜合子小鼠,檢測其胚胎組織中線粒體自噬標志蛋白TOM20的表達情況;利用H9c2細胞構建Zip7敲除及Zip7過表達的穩(wěn)定細胞株;用Western blotting法檢測TOM20、PINK1及Parkin的蛋白表達變化情況;利用Zip7 siRNA進行瞬時轉染,檢測TOM20蛋白表達;用Mitosox red熒光探針檢測線粒體內(nèi)超氧化物含量;用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位（△Ψm）的變化情況;用細胞免疫熒光技術觀察PINK1及Parkin在細胞內(nèi)的定位;用Zinpyr-1鋅離子綠色熒光探針檢測細胞內(nèi)鋅離子含量;利用RNA-Seq測序技術檢測并篩選Zip7基因敲除時自噬及線粒體自噬差異基因。結果1.QPCR及Western blotting結果顯示,與對照組相比,大鼠心臟缺血/再灌注組Zip7的mRNA及蛋白表達均升高。與對照組相比...
【文章頁數(shù)】：117 頁
【學位級別】：博士
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語
前言
研究現(xiàn)狀、成果
目的和方法
一、探討再灌注時Zip7表達變化及其與線粒體自噬的關系
1.1 對象和方法
1.1.1 研究對象
1.1.2 實驗儀器
1.1.3 常用試劑
1.1.4 關鍵試劑及試劑盒
1.1.5 抗體
1.1.6 H9c2 細胞的復蘇
1.1.7 H9c2 細胞的凍存
1.1.8 H9c2 細胞的傳代
1.1.9 細胞計數(shù)
1.1.10 建立H9c2 細胞缺氧/復氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型
1.1.11 建立大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型
1.1.12 利用CRISPR Cas9 技術建立Zip7 敲除的H9c2 細胞系
1.1.13 構建Zip7 過表達穩(wěn)定細胞株
1.1.14 H9c2 細胞siRNA轉染
1.1.15 GFP-LC3 質粒轉染
1.1.16 構建Zip7 基因敲除小鼠
1.1.17 RNA提取
1.1.18 RNA逆轉錄(RT-PCR)
1.1.19 Real-time PCR(QPCR)反應
1.1.20 蛋白免疫印跡(Western blotting)
1.1.21 Mitosox red檢測線粒體內(nèi)超氧化物
1.1.22 JC-1 檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位
1.1.23 細胞免疫熒光技術
1.1.24 Mitotracker red及 Zinpyr-1 共染法檢測線粒體內(nèi)鋅離子含量變化
1.1.25 線粒體的提取
1.1.26 統(tǒng)計學分析
1.2 結果
1.2.1 H9c2 細胞缺氧/復氧時Zip7 表達上調(diào)
1.2.2 大鼠離體心臟缺血/再灌注時Zip7 表達上調(diào)
1.2.3 鋅離子和TPEN不影響Zip7 的表達
1.2.4 BAPTA-AM可抑制H9c2 細胞復氧期Zip7 表達上調(diào)
1.2.5 EGTA可抑制H9c2 細胞復氧期Zip7 表達上調(diào)
1.2.6 CaCl2 可上調(diào)H9c2 細胞Zip7 蛋白表達
1.2.7 Zip7 siRNA使線粒體自噬增強
1.2.8 Zip7 基因敲除誘導自噬及線粒體自噬
1.2.9 Zip7 基因敲除小鼠自噬及線粒體自噬增強
1.2.10 Zip7 的過表達可抑制自噬及線粒體自噬
1.2.11 缺氧/復氧時Zip7 基因敲除促進線粒體自噬
1.2.12 Zip7 基因敲除減輕再灌注時線粒體ROS的產(chǎn)生
1.2.13 H9c2 細胞過表達Zip7 后線粒體內(nèi)ROS升高
1.3 討論
1.4 小結
二、探討Zip7 抑制線粒體自噬的分子機制
2.1 結果
2.1.1 Zip7 定位于H9c2 細胞線粒體
2.1.2 Zip7 敲除后H9c2 細胞線粒體內(nèi)鋅離子增多
2.1.3 Zip7 基因敲除使H9c2 細胞線粒體膜電位降低(去極化)
2.1.4 Zip7 過表達后H9c2 細胞線粒體膜電位升高
2.1.5 H9c2 細胞Zip7 基因敲除使PINK1 在線粒體的聚集增多
2.1.6 Zip7 基因敲除使Parkin在線粒體的聚集增多
2.1.7 敲降Parkin可抑制Zip7 誘導的線粒體自噬
2.2 討論
2.3 小結
全文結論
論文創(chuàng)新點
參考文獻
發(fā)表論文和參加科研情況說明
附錄
綜述 鋅轉運體Zip7 與線粒體自噬
綜述參考文獻
致謝
個人簡歷
本文編號：4030599
【文章頁數(shù)】：117 頁
【學位級別】：博士
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語
前言
研究現(xiàn)狀、成果
目的和方法
一、探討再灌注時Zip7表達變化及其與線粒體自噬的關系
1.1 對象和方法
1.1.1 研究對象
1.1.2 實驗儀器
1.1.3 常用試劑
1.1.4 關鍵試劑及試劑盒
1.1.5 抗體
1.1.6 H9c2 細胞的復蘇
1.1.7 H9c2 細胞的凍存
1.1.8 H9c2 細胞的傳代
1.1.9 細胞計數(shù)
1.1.10 建立H9c2 細胞缺氧/復氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型
1.1.11 建立大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型
1.1.12 利用CRISPR Cas9 技術建立Zip7 敲除的H9c2 細胞系
1.1.13 構建Zip7 過表達穩(wěn)定細胞株
1.1.14 H9c2 細胞siRNA轉染
1.1.15 GFP-LC3 質粒轉染
1.1.16 構建Zip7 基因敲除小鼠
1.1.17 RNA提取
1.1.18 RNA逆轉錄(RT-PCR)
1.1.19 Real-time PCR(QPCR)反應
1.1.20 蛋白免疫印跡(Western blotting)
1.1.21 Mitosox red檢測線粒體內(nèi)超氧化物
1.1.22 JC-1 檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位
1.1.23 細胞免疫熒光技術
1.1.24 Mitotracker red及 Zinpyr-1 共染法檢測線粒體內(nèi)鋅離子含量變化
1.1.25 線粒體的提取
1.1.26 統(tǒng)計學分析
1.2 結果
1.2.1 H9c2 細胞缺氧/復氧時Zip7 表達上調(diào)
1.2.2 大鼠離體心臟缺血/再灌注時Zip7 表達上調(diào)
1.2.3 鋅離子和TPEN不影響Zip7 的表達
1.2.4 BAPTA-AM可抑制H9c2 細胞復氧期Zip7 表達上調(diào)
1.2.5 EGTA可抑制H9c2 細胞復氧期Zip7 表達上調(diào)
1.2.6 CaCl2 可上調(diào)H9c2 細胞Zip7 蛋白表達
1.2.7 Zip7 siRNA使線粒體自噬增強
1.2.8 Zip7 基因敲除誘導自噬及線粒體自噬
1.2.9 Zip7 基因敲除小鼠自噬及線粒體自噬增強
1.2.10 Zip7 的過表達可抑制自噬及線粒體自噬
1.2.11 缺氧/復氧時Zip7 基因敲除促進線粒體自噬
1.2.12 Zip7 基因敲除減輕再灌注時線粒體ROS的產(chǎn)生
1.2.13 H9c2 細胞過表達Zip7 后線粒體內(nèi)ROS升高
1.3 討論
1.4 小結
二、探討Zip7 抑制線粒體自噬的分子機制
2.1 結果
2.1.1 Zip7 定位于H9c2 細胞線粒體
2.1.2 Zip7 敲除后H9c2 細胞線粒體內(nèi)鋅離子增多
2.1.3 Zip7 基因敲除使H9c2 細胞線粒體膜電位降低(去極化)
2.1.4 Zip7 過表達后H9c2 細胞線粒體膜電位升高
2.1.5 H9c2 細胞Zip7 基因敲除使PINK1 在線粒體的聚集增多
2.1.6 Zip7 基因敲除使Parkin在線粒體的聚集增多
2.1.7 敲降Parkin可抑制Zip7 誘導的線粒體自噬
2.2 討論
2.3 小結
全文結論
論文創(chuàng)新點
參考文獻
發(fā)表論文和參加科研情況說明
附錄
綜述 鋅轉運體Zip7 與線粒體自噬
綜述參考文獻
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