發(fā)布時間：2025-06-21 04:20

　　目的:為了研究自發(fā)性高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化性疾病,針對兔LDLR和ApoE基因,使用CRISPR/Cas9基因編輯工具制備低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR)和/或載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因缺失的自發(fā)性高膽固醇血癥兔模型。方法:本研究使用CRISPR/Cas9系統(tǒng),分別針對兔LDLR基因第2外顯子設計1對sgRNA(sgRNA1、sgRNA2)和第7外顯子設計1對sgRNA(sgRNA3、sgRNA4),以及針對ApoE基因第1外顯子設計1對sgRNA(sgRNA5、sgRNA6)。將經過體外轉錄獲得的Cas9 mRNA和不同的sgRNA分組顯微注射至不同受精卵的細胞質內,分組如下:①Cas9mRNA和 sgRNA1、sgRNA3、sgRNA6;②Cas9mRNA 和 sgRNA2、sgRNA4、sgRNA5;③Cas9mRNA和sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4;④Cas9mRNA和sgRNA5、sgRNA6。將注射好的受精卵胚胎移植至受體中,代孕,獲得原代兔。對原代兔進行基因型鑒定、編碼氨基酸和蛋白結構模擬分...

【文章頁數】：88 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
總體研究方案和創(chuàng)新點
符號說明
前言
第一章 Cas9 mRNA和sgRNA的準備
    1. 實驗材料
        1.1 主要實驗器材
        1.2 主要試劑藥品
        1.3 常用試劑的配制
    2. 實驗方法
        2.1 兔LDLR和ApoE基因的檢索
        2.2 兔LDLR和ApoE基因修飾位點的篩選和sgRNA的設計
        2.3 CRISPR/Cas9二合一質粒構建及鑒定
        2.4 體外轉錄為mRNA
    3. 實驗結果
        3.1 LDLR和ApoE基因修飾位點的設計
        3.2 sgRNA的寡核苷酸鏈引物的設計
        3.3 CRISPR/Cas9二合一質粒構建及鑒定
    總結和計劃
第二章 利用多sgRNA靶向敲除兔LDLR和/或ApoE基因
    1. 實驗材料
        1.1 主要實驗器材
        1.2 主要試劑藥品
        1.3 實驗動物
        1.4 常用試劑的配制
    2. 實驗方法
        2.1 供受體的準備
        2.2 收集供體兔的受精卵
        2.3 sgRNAs和Cas9mRNA顯微注射至受精卵
        2.4 胚胎移植
        2.5 胚胎移植后受體兔孕期與分娩護理
        2.6 原代兔的基因鑒定
        2.7 脫靶位點的預測與檢測
        2.8 突變兔的表型檢測
    3. 實驗結果
        3.1 原代兔PCR結果
        3.2 突變兔的基因型
        3.3 脫靶分析
        3.4 突變兔的血脂濃度檢測
        3.5 突變兔的血漿載脂蛋白分析
        3.6 突變兔的血漿脂蛋白類型分析
        3.7 動脈粥樣硬化組織病理分析
    小結和計劃
第三章 第7外顯子突變的自發(fā)性高膽固醇血癥LDLR-/-兔模型的制備
    1. 實驗材料
    2. 實驗方法
        2.1 sgRNA和Cas9mRNA顯微注射至受精卵
        2.2 蛋白結構預測
        2.3 突變兔血漿FPLC分析
        2.4 血漿炎性介質(IL-1β、IL-6、CCL2)的測定和血漿白細胞計數
        2.5 Masson三色染色
    3. 實驗結果
        3.1 突變兔的基因型
        3.2 突變兔的編碼氨基酸
        3.3 蛋白結構模擬
        3.4 血脂檢測
        3.5 血漿炎癥因子檢測
        3.6 血漿白細胞計數
        3.7 血漿載脂蛋白和脂蛋白的分析
        3.8 動脈粥樣硬化分析
    小結
第四章 ApoE^-/-兔模型的制備
    1. 實驗材料
    2. 實驗方法
    3. 實驗結果
        3.1 突變兔基因型
        3.2 蛋白結構分析
        3.3 血漿ApoE蛋白檢測
        3.4 血脂含量檢測
        3.5 子代兔的檢測
    小結
全文討論
全文總結
綜述
    1. 高膽固醇血癥的研究進展
    2. 與高膽固醇血癥有關的基因
        2.1 低密度脂蛋白受體(LDLR)
        2.2 前蛋白轉化酶枯草溶菌素9 (PSCK-9)
        2.3 載脂蛋白B (ApoB)
        2.4 載脂蛋白E (ApoE)
        2.5 LDLR銜接蛋白1 (LDLRAP1)
        2.6 小結
    3. 高膽固醇血癥的治療進展與前景
        3.1 藥物治療
        3.2 基因治療
    4. 動脈粥樣硬化(AS)的研究現(xiàn)狀
        4.1 發(fā)病機制
        4.2 診斷治療
    5. 動脈粥樣硬化動物模型的選擇
    6. CRISPR/Cas9系統(tǒng)的前景與挑戰(zhàn)
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表論文及科研情況
致謝



本文編號：4051905