發(fā)布時間：2020-10-21 12:24

　　 目的:熱射病(heatstroke,HS)是一種危及生命的疾病,熱應(yīng)激時在各類細胞因子和炎癥因子的共同作用下,內(nèi)皮細胞(endothelial cell)早期即可被激活且功能受損,而損傷的內(nèi)皮細胞可進一步加重炎癥反應(yīng),最終導致多器官功能衰竭的發(fā)生。丹參酮IIA磺酸鈉(TanshinoneIIA sulfonate,STS)在血管內(nèi)皮保護中具有許多作用。目前研究表明,STS能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡,并減輕高溫引起的大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。因此,探討STS治療對熱打擊的內(nèi)皮細胞的影響對于防治中暑及闡明高熱對內(nèi)皮細胞的損傷機制具有重要的理論與實踐意義。綜上,本研究旨在闡釋丹參酮IIA磺酸鈉(TanshinoneIIA sulfonate,STS)治療對熱打擊內(nèi)皮細胞的影響以及細胞對STS治療的反應(yīng)機制。方法:1.CCK-8法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)細胞在42℃暴露不同時長的細胞活性,Annexin V/PI流式細胞術(shù)檢測熱誘導不同時長對HUVEC細胞凋亡率的影響,Western-blotting檢測熱誘導后HUVEC細胞中凋亡相關(guān)分子變化,探討熱誘導對HUVEC細胞凋亡水平的影響。2.HUVEC細胞在STS不同濃度作用下細胞活性改變,及熱誘導后恢復(fù)不同的時長HUVEC細胞的活性改變,以此篩選STS的作用濃度,和熱誘導后的恢復(fù)時間。3.CCK-8法檢測HUVEC細胞在STS作用下細胞活性的變化,Annexin V/PI流式細胞術(shù)檢測STS對熱誘導的HUVEC細胞凋亡率的影響,利用caspase活性檢測試劑盒檢測凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的活性。探討STS在熱誘導的環(huán)境中對HUVEC細胞的保護作用。4.探討STS對熱誘導引起HUVEC細胞凋亡影響的機制。硝酸鹽/亞硝酸鹽比色分析法檢測STS對熱誘導不同時長HUVEC細胞中亞硝酸鹽產(chǎn)量的影響,western blot檢測不同時間點eNOS的磷酸化水平,利用eNOS的抑制劑L-NMMA阻斷eNOS的磷酸化,檢測STS對阻斷eNOS后HUVEC細胞中eNOS磷酸化的影響、STS對高溫引起的HUVEC細胞活性及細胞凋亡率的影響。初步探討NO與熱誘導引起的HUVEC細胞凋亡的相關(guān)性。5.探討熱誘導的HUVEC細胞中eNOS的磷酸化是否由Akt的磷酸化而調(diào)節(jié)。利用western blot檢測STS對熱誘導不同時間點HUVEC細胞中Akt磷酸化情況的影響,STS對阻斷Akt磷酸化后HUVEC細胞中eNOS的影響,利用了Akt的抑制劑MK-2206后,利用western blot檢測STS對熱誘導不同時間點HUVEC細胞中Akt磷酸化情況。6.探索STS誘導的Akt磷酸化或eNOS磷酸化是否通過PI3激酶依賴的調(diào)控機制所控制。利用PI3K抑制劑Wortmannin,western blot檢測高溫環(huán)境下STS引起的HUVEC細胞中磷酸化的Akt及磷酸化的eNOS的變化。抑制劑MK-2206、Wortmannin對熱誘導下HUVEC細胞凋亡的影響。結(jié)果:1.HUVEC細胞在42℃暴露不同時長細胞活性隨時間延長而降低,熱誘導不同時長HUVEC細胞凋亡率隨時間延長而增高,熱誘導后HUVEC細胞中cleaved-caspase-3隨時間延長而蛋白表達水平增高。2.STS作用濃度為2μg/ml時,熱誘導后的HUVEC細胞活性有明顯改善;在恢復(fù)2小時時STS的保護作用已顯現(xiàn);當恢復(fù)時間越來越長,細胞在無藥物作用下活性也會有一定程度的回升,且即使STS作用濃度非常低(0.002μg/ml)也能有保護細胞的作用。3.在暴露于42℃中1小時后,可以觀察到在熱誘導后細胞有變圓和脫落的現(xiàn)象,而用STS(2μg/ml)處理后這種現(xiàn)象有了明顯的減輕。從細胞活性檢測的情況看,在暴露于42℃中1小時后,可以觀察到在熱誘導后細胞活性降低,而用STS(2μg/ml)處理后細胞活性有了一定程度的回升。在用STS(2μg/ml)處理后再將細胞暴露于42℃中1小時,相對于STS未處理的熱誘導組細胞,STS處理后使熱誘導的HUVEC細胞凋亡率明顯減少,結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學差異。熱誘導的HUVEC細胞在STS作用后,凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的活性降低。探討STS在熱誘導的環(huán)境中對HUVEC細胞的保護作用。4.在沒有STS處理時,熱誘導下HUVEC細胞的亞硝酸鹽生成量在0.5小時顯著增加,1和2小時急劇下降,亞硝酸鹽產(chǎn)量在2小時處于基線水平。而經(jīng)STS(2μg/ml)處理的HUVEC細胞,在熱誘導后細胞中亞硝酸鹽的生產(chǎn)逐漸增加,在1小時達到穩(wěn)定狀態(tài),顯著高于同時期未用STS處理的HUVEC細胞中亞硝酸鹽的水平。HUVEC細胞中的eNOS蛋白磷酸化水平在熱誘導后15分鐘和30分鐘時有所增加,在1小時和2小時時eNOS的磷酸化又有所降低,經(jīng)過STS(2μg/ml)處理后,HUVEC細胞中eNOS磷酸化從熱誘導后15分鐘到1小時呈持續(xù)增加。在L-NMMA預(yù)處理后,即使有STS的作用,HUVEC細胞在熱誘導后,eNOS的磷酸化水平無明顯改變。此外,L-NMMA的預(yù)處理使高溫引起的HUVEC細胞活性減弱,在STS作用后情況并無改觀。同樣,L-NMMA的預(yù)處理使高溫引起的HUVEC細胞cleaved-caspase-3表達增多,STS作用對這個情況也無改觀。5.在沒有STS處理的情況下,和熱誘導1小時和2小時相比,在熱誘導15分鐘和30分鐘時HUVEC細胞中磷酸化Akt水平增高。然而,如果經(jīng)STS(2μg/ml)作用后,Akt磷酸化隨時間的延長持續(xù)增加,在1小時時趨于穩(wěn)定。MK-2206預(yù)處理后,熱誘導的HUVEC細胞在MK-2206預(yù)處理后可以抑制STS誘導的eNOS磷酸化增強,同樣,MK-2206預(yù)處理可顯著抑制STS對高溫下HUVEC細胞中亞硝酸鹽產(chǎn)量的影響。6.Wortmannin抑制了高溫環(huán)境下STS引起的HUVEC細胞中eNOS和Akt的磷酸化的增強。此外,Wortmannin的預(yù)處理也可以抑制STS引起的高溫時HUVEC細胞中增加亞硝酸鹽的含量。MK-2206預(yù)處理導致熱誘導的HUVEC細胞凋亡比例的增加,這一情況無論是否加入STS都無法改變。MK-2206預(yù)處理導致熱誘導的HUVEC細胞中裂解的caspase-3表達增高,這一情況同樣不受STS的影響。結(jié)論:1.熱應(yīng)激可誘導HUVEC細胞凋亡,隨著熱誘導時間的延長凋亡率增加;2.適量的STS可以抑制熱應(yīng)激引起的HUVEC細胞凋亡;3.STS作用可以激活PI3K/Akt通路,使eNOS磷酸化增加,從而導致HUVEC在熱應(yīng)激狀態(tài)下一氧化氮(NO)產(chǎn)生增多。STS可以通過PI3K/AKT/eNOS途徑抑制熱應(yīng)激引起的HUVEC細胞凋亡。意義:本研究初步闡明了STS對熱誘導HUVEC細胞凋亡影響的相關(guān)作用機制,同時也反映出HUVEC細胞針對高熱做出的應(yīng)答反應(yīng),為探尋熱射病損傷內(nèi)皮細胞機制提供了實驗依據(jù),也為輔助治療提供了潛在作用靶點。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R594.12
【部分圖文】：

是由于與高熱引起的一些急性生理改變之間復(fù)雜的相互作用（例如，循環(huán)衰竭，??缺氧和代謝需求增加）而產(chǎn)生的，熱的直接細胞毒作用，與宿主炎癥和凝血反應(yīng)。??這一系列事件導致微循環(huán)血流改變，導致血管內(nèi)皮和組織損傷（如圖１－１所示）。??５??

參酮ＩＩＡ磺酸鈉預(yù)防血管內(nèi)皮細胞凋亡的分子機制研究結(jié)?果??測熱誘導不同時長ＨＵＶＥＣ細胞的相對ＨＵＶＥＣ細胞活性產(chǎn)生的影響，我們用ＣＣＫ－８活露不同時間的ＨＵＶＥＣ細胞活性。ＨＵＶＥＣ細胞在４、０．５小時、１小時、１．５小時、２小時、２．５小時、３檢測細胞活性隨著時間的延遲而減少（圖２－１）。??－

２－２－１ＨＵＶＥＣ、（Ｃ）、（Ｄ）分別表示熱誘導０小時、１小時、２小時、４小時后Ａｎｎｅｘｉｎ?ＨＵＶＥＣ細胞的凋亡率。??１００－１??ｇ?一??ｗ?８０－?丁??ａ?？??＞?６０－??Ｉ?丁??＾?４０－?？??０?－Ｉ—??〇?２０．??Ｓ：??〇－＊—Ｉ?．?．??＾?＾?＾??Ｈｅａｔ?Ｔｒｅａｔｅｄ?Ｔｉｍｅ??圖２－２－１熱誘導不同時間點ＨＵＶＥＣ細胞凋亡率統(tǒng)計??
【參考文獻】

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本文編號：2850112