發(fā)布時間：2020-11-01 09:20

　　 目的:本研究旨在:1.分析比較脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)大鼠肺泡灌洗液(Broncho Alveolar Lavage Fluid,BALF)、脾臟及外周血3種不同來源的巨噬細胞原代提取及培養(yǎng)方法。2、探討亞低溫(Mild Hypothermia,MHT)處理對LPS誘導的ARDS大鼠肺泡巨噬細胞(Alveolar Macrophage,AM)Toll樣受體4蛋白及下游促炎介質(zhì)的影響。研究方法:1、采用密度梯度離心法提取LPS誘導的ARDS SD(Sprang-Daley)大鼠BALF、脾臟及外周血中的原代巨噬細胞,通過免疫化學染色的方法對提取細胞進行鑒定、計數(shù)及純度計算,并采用細胞增殖活性檢測(Cell Counting Kit-8,CCK-8)試劑盒檢測三種方法提取的原代巨噬細胞活性。2、分析亞低溫處理對經(jīng)LPS誘導的ARDS大鼠AM TLR4蛋白及下游促炎介質(zhì)的影響。通過建立大鼠ARDS模型,分析相關(guān)TLR4、My D88、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factors-α,TNF-α)及誘導型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)的變化。分別在原代巨噬細胞中加入濃度為0ug/ml,1ug/ml,5ug/ml,8ug/ml,10ug/ml,15ug/ml的LPS,通過CCK-8試劑盒對LPS干預原代巨噬細胞進行最適濃度梯度測定后,使用完全培養(yǎng)基,在溫度37℃,體積分數(shù)5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)原代巨噬細胞24h后,隨機將細胞分為亞低溫組和常溫(Normothermia,NT)組,分別置于32℃和37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每組再隨機分為LPS干預組和磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)對照組;LPS干預組加入5g/ml LPS進行干預,對照組加入等量PBS。分別在培養(yǎng)0h、1h、4h、8h、16h及24h提取巨噬細胞RNA,采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-Time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測巨噬細胞TNF-α和i NOS m RNA表達變化;并提取巨噬細胞培養(yǎng)上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和i NOS的表達變化;在培養(yǎng)1h、4h、8h、16h及24h提取巨噬細胞總蛋白,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blotting,WB)檢測巨噬細胞TLR4和My D88蛋白的表達變化。結(jié)果:1.肺泡灌洗液、脾臟及外周血三種方法提取的原代巨噬細胞個數(shù)均值分別為(1.14±0.14)×106個、(9.29±0.19)×106個及(3.17±0.13)×106個,三組間兩兩比較差異有顯著性意義(P0.05);三種方法提取的原代巨噬細胞的活性比較,肺泡灌洗液提取出的巨噬細胞顯著高于另2組(P0.05),而脾臟與外周血提取的原代巨噬細胞差異無顯著性意義(P0.05);三種方法提取的原代巨噬細胞通過免疫化學檢測,得出細胞純度分別為(95.779±1.170)%,(94.132±1.412)%,(94.012±0.954)%,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.通過CCK-8試劑盒對LPS干預原代巨噬細胞進行最適濃度梯度測定后,得出最適LPS濃度為5ug/ml。3.巨噬細胞TLR4及My D88蛋白的表達:與常溫組比較,TLR4蛋白表達量于亞低溫干預后4h、8h、16h、24h明顯下降(4h:0.376±0.011比0.262±0.032,8h:0.588±0.040比0.390±0.029;16h:0.767±0.013比0.555±0.050,24h:0.493±0.026比0.317±0.031,均P0.05);My D88蛋白于亞低溫干預后1h、4h、8h、16h明顯下降(1h:0.433±0.016比0.240±0.034,4h:0.524±0.026比0.351±0.020,8h:0.636±0.034比0.395±0.011;16h:0.726±0.008比0.568±0.023,均P0.05)。4.巨噬細胞TNF-αm RNA、i NOS m RNA表達(2﹣△△Ct):與常溫組比較,亞低溫組TNF-αm RNA及i NOS m RNA表達于干預后1h、4 h、8 h、16 h和24 h明顯下降(TNF-αm RNA:1h:0.802±0.244ng/L比0.366±0.074ng/L,4h:1.644±0.157ng/L比0.771±0.121ng/L,8 h:3.213±0.857ng/L比2.007±0.690ng/L,16 h:7.916±2.292ng/L比3.944±0.447ng/L,24 h:4.116±1.340ng/L比2.517±1.165ng/L;i NOSm RNA:1h:0.679±0.147ng/L比0.366±0.129ng/L,4h:1.170±0.148ng/L比0.797±0.101ng/L,8 h:2.403±0.307ng/L比1.193±0.097ng/L,16 h:4.986±1.131ng/L比3.252±0.768ng/L,24 h:8.867±1.395ng/L比4.529±1.395ng/L,均P0.05)。5.巨噬細胞培養(yǎng)上清液TNF-α、i NOS炎癥介質(zhì)的表達:與常溫組比較,亞低溫組TNF-α表達于干預后4 h、8 h、16 h和24 h明顯下降、i NOS表達于干預后1h、4 h、8 h、16 h和24 h明顯下降(TNF-α:4h:128.859±23.667ng/L比48.784±7.627ng/L,8 h:214.136±14.460ng/L比110.594±5.957ng/L,16 h:390.949±5.789ng/L比216.305±11.229ng/L,24 h:600.659±9.415ng/L比348.981±15.844ng/L;i NOS m RNA:1h:84.297±0.582ng/L比64.798±5.479ng/L,4h:134.043±6.205ng/L比71.458±3.866ng/L,8 h:285.510±69.423ng/L比133.124±34.114ng/L,16 h:737.387±160.174ng/L比304.097±51.948ng/L,24 h:431.907±42.335ng/L比237.965±8.985ng/L,均P0.05)。結(jié)論:1、三種方法提取的原代巨噬細胞相較,巨噬細胞純度差別無統(tǒng)計學意義,肺泡灌洗液提取的原代巨噬細胞活性最強,脾臟提取的原代巨噬細胞數(shù)量最多,外周血提取的原代巨噬細胞活性及數(shù)量介于兩者之間。2、亞低溫下調(diào)LPS誘導ARDS大鼠肺泡灌洗液巨噬細胞TLR4/My D88信號通路,從而抑制炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及表達。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R563.8
【部分圖文】：

and DAPI nuclear staining（10×）4. CCK-8檢測細胞活性CCK-8檢測細胞活性結(jié)果表明（表1-1，圖1-3），3組所獲取的原代細胞活性比較，4個時間點的肺泡灌洗液提取的原代巨噬細胞檢測出的吸光度值均顯著高于其他2個培養(yǎng)組，差異均有顯著性意義(P < 0.05)，肺泡灌洗液提取的原代巨噬細胞活性最高，脾臟組織及外周血提取出的原代巨噬細胞活性差別在1 h與1.5 h無顯著性意義(P > 0.05)，在0.5 h與2 h組差異均有顯著性意義(P <0.05)；3個培養(yǎng)組與空白組之間兩兩比較，差異均有顯著性意義(P < 0.05)。

濃度（ug/ml）時間（h）0.5 1 1.5 20 0.127±0.006 0.345±0.025a0.392±0.017a0.558±0.031 0.350±0.027a0.446±0.014a0.425±0.040a0.608±0.005 0.460±0.022a0.507±0.048a0.798±0.059ab1.066±0.058 0.462±0.032a0.512±0.048a0.705±0.131a1.020±0.0110 0.322±0.014a0.383±0.062a0.417±0.009a0.771±0.0215 0.200±0.077 0.250±0.041 0.380±0.037a0.764±0.03空白對照組 0.141±0.021 0.197±0.017 0.212±0.016 0.264±0.0F 63.634 37.211 47.956 284.67P 0.000 0.000 0.000 0.000表注：與空白對照組相比，aP<0.05； 5ug/ml、8ug/ml 兩組間相比bP <0.05；LPS 濃度為 5ug/ml、8ug/ml 兩組的 OD 值與其他組相同時間相比差別均有統(tǒng)計學差異（P <0.05）;而在其他相同時間差別無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。H

低溫對急性呼吸性窘迫綜合征大鼠肺泡巨噬細胞 Toll 樣受體 4 蛋白及下游促炎介質(zhì)的影響 2019 屆碩士學位論文結(jié) 果1. RT-PCR 檢測巨噬細胞中 TNF- （圖 2-2；表 2-7）和 iNOS（圖 2表 2-8）的 mRNA 表達首先進行 PCR 反應檢測 iNOS 及 TNF- 電泳擴增片段（圖 2-1）。亞對照組和常溫對照組中 TNF- 及 iNOS 的 mRNA 表達沒有顯著變化，亞干預組和常溫干預組首先隨時間變化逐漸增加，16h 達高峰，然后逐漸下預組 1h 后亞低溫組 TNF- 和 iNOS mRNA 表達明顯低于常溫組（P <0.0低溫組 TNF- 和 iNOSmRNA 表達水平顯著低于常溫組（P <0.05）。
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本文編號：2865331