發(fā)布時間：2020-11-16 18:20

　　 目的:MSCs的歸巢在骨折損傷修復中發(fā)揮重要的作用,非編碼微小RNA(miRNA)在MSCs歸巢中的作用仍未明確。既往研究表明補腎活血湯的石油醚提取物能有效促進MSCs體外遷移。本研究通過補腎活血湯石油醚提取物干預MSCs,篩選差異性表達miRNA并以此為切入點,闡明補腎活血湯石油醚提取物促進MSCs遷移過程中的關鍵miRNA在MSCs遷移的作用,為中醫(yī)藥治療骨折提供新策略和藥理靶點。方法:采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)SD大鼠MSCs,通過細胞表面抗原流式細胞儀檢測P3代MSCs,并鑒定其成脂和成骨分化潛能。利用CCK-8法檢測補腎活血湯石油醚提取物對MSCs增殖的影響。Transwell實驗觀察補腎活血湯石油醚提取物對MSCs細胞遷移的影響,qRT-PCR檢測檢測補腎活血湯石油醚提取物對Wnt5a及JNK、PKC、CaMKII的mRNA表達的影響。并通過siRNA沉默Wnt5a觀察對MSCs遷移的影響。接著利用miRNA高通量測序技術篩選補腎活血湯石油醚提取物干預MSCs后差異表達的miRNA,結合qRT-PCR驗證篩選出差異表達的miRNA。利用miRNA mimic和inhibitor轉染MSCs后行Transwell實驗和劃痕實驗對miRNA的功能進行驗證。利用生物信息學預測軟件進行靶基因預測、進行雙熒光素酶報告基因實驗和Western blot檢測確定miRNA調控的靶基因。結果:流式細胞學檢測細結果顯示所培養(yǎng)P3代細胞高表達CD90和CD44(表達率97.44%和96.55%),低表達CD45和CD34(表達率0.14%和0.21%)。并且成功誘導形成骨細胞及脂肪細胞,符合干細胞的特性。CCK-8實驗結果顯示,各濃度組(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)補腎活血湯石油醚干預都能促進MSCs增殖。Transwell實驗表明各濃度組(1μg/ml、10μg/ml和10Cμg/ml)補腎活血湯石油醚處理后明顯促進MSCs遷移,其中補腎活血湯石油醚促進遷移的最佳濃度是10μg/ml。qRT-PCR結果顯示各濃度組(1μg/ml、10μg/ml 和 100μg/ml)補腎活血湯石油醚均能促進Wnt5a及 JNK、PKC、CaMKII mRNA的表達。轉染siRNA沉默Wnt5a后,MSCs遷移能力明顯下降。miRNA高通量測序篩選出補腎活血湯石油醚干預后差異倍數(shù)大于2的miRNA有70個,其中高表達miRNA有27條,低表達miRNA有43條。對12條差異表達較大的且與細胞遷移相關的miRNA進行qRT-PCR驗證,發(fā)現(xiàn)miR-539呈現(xiàn)低表達。Transwell實驗和劃痕實驗顯示過表miR-539能抑制MSCs遷移,低表達miR-539能促進MSCs遷移。靶基因預測和雙熒光素報告基因檢查發(fā)現(xiàn)Wnt5a為miR-539的調控靶點。Western blot檢測結果顯示過表達miR-539能抑制Wnt5a蛋白表達。結論:補腎活血湯石油醚提取物能有效促進MSCs增殖。補腎活血湯石油醚提取物能有效促進MSCs遷移,其作用機制可能通過下調miR-539,靶向Wnt5a信號通路所實現(xiàn)。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5

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本文編號：2886517