發(fā)布時間：2020-06-13 16:22

【摘要】：目的:在腦原位和轉(zhuǎn)移性腫瘤中,腫瘤微環(huán)境是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因素。通過免疫組織化學(xué)染色和流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細胞以及其他不同類型的非腫瘤細胞,主要有星型膠質(zhì)細胞、周皮細胞、內(nèi)皮細胞和多種免疫細胞。這些免疫細胞主要包括腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)、小膠質(zhì)細胞、骨髓來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)和T細胞等,這些免疫細胞在特定條件下可以促進膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境的形成,進而促進其生長和轉(zhuǎn)移。CD30L屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員,主要表達在活化的T細胞和B細胞,還可以表達在巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)的表面。CD30L可以促進霍奇金淋巴瘤的生長和增殖,同時作為免疫調(diào)節(jié)分子,參與多種自身免性疫疾病的病變形成,并發(fā)揮重要作用。以往有關(guān)CD30L與腫瘤的相關(guān)研究多局限在淋巴系或血液來源腫瘤范疇,而對于腦膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的形成,以及膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究目前尚屬空白。因此,本課題利用Cd30l基因敲除小鼠(CD30LKO),顱內(nèi)接種鼠膠質(zhì)瘤細胞系-GL261建立膠質(zhì)瘤模型,初步探討Cd30l基因缺失對小鼠膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的形成及腫瘤進展的影響,為今后進一步深入研究CD30L在實體臟器腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供重要的理論基礎(chǔ)。研究方法:1、利用C57BL/6(wild-type,WT)、CD30LKO小鼠和尾靜脈回輸m CD30-Ig抗體的WT小鼠,顱內(nèi)接種GL261膠質(zhì)瘤細胞系建立小鼠膠質(zhì)瘤模型,觀察其生存率。2、通過免疫印跡的方法,檢測正常WT小鼠腦組織、種瘤21天后WT小鼠癌旁組織和腫瘤組織內(nèi)CD30L蛋白水平的改變;通過免疫熒光的方法,檢測GL261細胞表面CD30L的表達;通過流式細胞術(shù)檢測WT小鼠種瘤21天后,腫瘤浸潤的TAM表面CD30L的表達。3、通過HE染色,觀察種瘤21天后WT、CD30LKO和尾靜脈回輸m CD30-Ig抗體的WT小鼠腦組織病理改變,并且估算其膠質(zhì)瘤的體積。4、通過流式細胞術(shù),比較種瘤21天后WT和CD30LKO小鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)的小膠質(zhì)細胞、TAM和MDSC細胞亞群、細胞數(shù)量以及細胞功能性分子的變化。5、通過流式細胞術(shù),比較種瘤21天后WT和CD30LKO小鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)CD8+T細胞的表型和功能的變化。研究結(jié)果:1、在小鼠膠質(zhì)瘤模型中,與WT小鼠相比,Cd30l基因缺失或CD30L分子阻斷后,引起小鼠生存率下降。2、在小鼠膠質(zhì)瘤模型中,與正常小鼠腦組織相比,膠質(zhì)瘤腫瘤組織和癌旁組織中CD30L的表達量明顯升高;GL261細胞系和膠質(zhì)瘤浸潤的TAM中表達CD30L。3、種瘤21天后,與WT小鼠相比,Cd30l基因缺失或CD30L分子阻斷后,引起小鼠腫瘤體積增大。4、種瘤21天后,與WT小鼠相比,CD30LKO小鼠腫瘤浸潤的小膠質(zhì)細胞、TAM、CD45+CD11b-的細胞比例和數(shù)量增加;CD30LKO小鼠腫瘤浸潤的TAM和MDSC亞群的細胞比例和數(shù)量增加;CD30LKO小鼠腫瘤內(nèi)TAM和小膠質(zhì)細胞的表型更加促進腫瘤生長。5、種瘤21天后,與WT小鼠相比,CD30LKO小鼠腫瘤浸潤的CD8+PD-1+T細胞數(shù)量和比例明顯升高,CD8+T細胞的增殖能力減弱,同時CD8+T細胞分泌的效應(yīng)性細胞因子IFN-g和TNF-a的能力減弱,說明CD30L的缺乏引起CD8+T細胞的耗竭。結(jié)論:CD30L信號通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細胞、比例數(shù)量以及表型特征,在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中,發(fā)揮重要的保護性作用。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 1. CD30LKO 小鼠促進膠質(zhì)瘤的(A)通過免疫熒光檢測 GL261 小鼠膠質(zhì)瘤細胞系上 CD30CD30LKO 顱內(nèi)接種 5×105GL261-EGFP 膠質(zhì)瘤細胞系。通過流瘤相關(guān)巨噬細胞上 CD30L 的表達情況。(C)通過 WesternBlot 檢瘤21天后癌旁組織(P) 和腫瘤組織(T)中的表達情況。并且通過灰(D) 向 WT、CD30LKO 和尾靜脈回輸 mCD30-Ig 抗體的 WT 小膠質(zhì)瘤細胞系。觀察各組種瘤后的生存率 (****,P<0.0001).(E)計和尾靜脈回輸 mCD30-Ig 抗體的 WT 小鼠腫瘤體積(***,P<0.001天后 WT 小鼠、CD30LKO 小鼠以及回輸 mCD30-Ig 抗體的 WT分別為 50μm、2000μm 和 1000μm。

15圖 3. CD30L 的缺乏促進膠質(zhì)瘤內(nèi)部免疫細胞的浸潤(A) 在種瘤 21 天后，從 WT 和 CD30LKO 小鼠腦組織中提取浸潤的免疫細胞，計算浸潤的免疫細胞的細胞數(shù)量。(B) 通過流式細胞術(shù)檢測 WT 和 CD30LKO 小鼠膠質(zhì)瘤浸潤的的免疫細胞的亞群，，圈出 EGFP-的細胞，進一步分析 TAM（CD45hiCD11b+）、小膠質(zhì)細胞（CD45lowCD11b+）和 CD45+CD11b-細胞的比例和數(shù)量。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示（n=5）。*,P<0.05;**, P<0.01; ***, P<0.001.
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41

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本文編號：2711434