發(fā)布時間：2020-11-17 11:17

　　 目的:探究腦缺糖缺氧后CD99能否介導(dǎo)中性粒細胞穿越腦血管內(nèi)皮進而參與腦損傷炎性機制過程。方法:采用細胞實驗方法,將鼠腦血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3細胞系)在混合有基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)+ 10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%雙抗(Pen Strep,PS)的培養(yǎng)液中培養(yǎng),并在細胞培養(yǎng)箱孵育。采用密度梯度離心法從小鼠骨髓提取中性粒細胞:麻醉處死小鼠,無菌剝離下肢皮膚、肌肉,并提取下肢骨骨髓,使用低滲氯化鈉溶液(0.2%NaCl)裂解紅細胞,然后用高滲氯化鈉溶液(1.6%NaCl)平衡滲透壓。隨后將提取的白細胞用 PBS 懸浮,并用 Histopaque-1119(密度,1.119g/ml),Histopaque-1077(密度,1.077 g/ml)進行密度梯度離心,兩種離心液之間即為中性粒細胞。對提取的中性粒細胞使用瑞氏-吉姆薩染色進行染色確認。CD99在內(nèi)皮細胞以及中性粒細胞上的表達使用免疫熒光染色的方法檢測(內(nèi)皮細胞在爬片上培養(yǎng)2天,中性粒細胞均勻鋪在載玻片上,自然風(fēng)干),依次孵育一抗二抗并用顯微鏡觀察。用 Western Blot 方法檢測對照組、氧糖剝奪(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)組、白細胞介素-1(Interleukin-1,IL-1β)組、OGD+IL-1β組CD99、細胞間粘附分子-1(Intercellular-adhesion molecule,ICAM-1)、血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion mol ecule,PEC AM-1,CD31)蛋白表達量。將bEnd.3細胞系種在6孔板內(nèi)進行培養(yǎng),每組3孔,OGD時間3.5小時,IL-1β濃度10ng/ml,持續(xù)16小時,OGD+IL-1β組為IL-1β處理16h后進行OGD處理,處理結(jié)束提取蛋白進行Western Blot檢測。Western Blot操作不同時間重復(fù)3次。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)與 CD99 的關(guān)系研究,同樣采用WesternBlot檢測,將6孔板內(nèi)培養(yǎng)的細胞分為常氧組與OGD組,每組按0μM,25μM,50μM 3種不同濃度給予HIF-1α抑制劑PX478,各濃度各有3孔。然后分別置于常氧或OGD條件下。最后提取蛋白進行western blot檢測。在中性粒細胞遷移實驗中,將內(nèi)皮細胞在24孔板中培養(yǎng),待細胞80%聚集后,給予對照、OGD、OGD+抗-CD99、抗-CD99處理,CD99抗體濃度25μg/ml,孵育時間30分鐘。處理結(jié)束后加入中性粒細胞。顯微鏡下連續(xù)拍攝,計數(shù)穿過鼠腦血管內(nèi)皮的中性粒細胞,每組至少重復(fù)3次,使用Image J1.46r軟件計數(shù)穿過內(nèi)皮細胞的中性粒細胞,并與粘附的細胞數(shù)相比進行標(biāo)準化處理。使用GraphPadPrism 5進行統(tǒng)計分析。數(shù)值用均值土標(biāo)準差表示,采用單因素方差分析比較,組間比較用Newman-Keuls事后檢驗。組間差異用p值表示*p0.05,**p0.01。結(jié)果:bEnd.3內(nèi)皮細胞及中性粒細胞均可表達CD99,并且在bEnd.3內(nèi)皮細胞表面表達均勻,不僅是表達在細胞連接位置;OGD后內(nèi)皮細胞CD99、ICAM-1、PECAM-1表達均升高(對照組對OGD組p0.05),IL-1β處理后ICAM-1升高(對照組對 IL-1β組 p0.01),CD99 表達下降(OGD 組對 OGD+IL-1 β 組 p0.01),PECAM-1無改變。OGD后干擾HIF-1α的表達不影響CD99的表達;OGD組與對照組、OGD+抗-CD99組相比,穿過血管內(nèi)皮的中性粒細胞數(shù)明顯增多(對照組對 OGD 組 p0.01,OGD 組對 OGD+抗CD99 組 p0.01)。結(jié)論:氧糖剝奪后,腦血管內(nèi)皮細胞CD99表達升高,并且這種升高不依賴于HIF-1α,CD99具有介導(dǎo)外周中性粒細胞穿越腦血管內(nèi)皮細胞進而參與缺血性腦損傷的炎性過程的作用。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
Abstract
第一章 緒論
    參考文獻
第二章 氧糖剝奪后CD99介導(dǎo)中性粒細胞穿過腦血管內(nèi)皮參與缺血性腦損傷炎性機制的研究
    引言
    材料與方法
        內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及中性粒細胞提取
        瑞氏-吉姆薩染色
        免疫熒光
        Western Blot
        中性粒細胞遷移比較
        統(tǒng)計分析
    結(jié)果
        內(nèi)皮細胞及中性粒細胞CD99表達
        IL-1β和OGD對CD99表達的影響
        OGD之后HIF-1α不介導(dǎo)CD99表達升高
        CD99介導(dǎo)OGD后中性粒細胞穿過鼠腦血管內(nèi)皮細胞
    討論
    結(jié)論
    參考文獻
第三章 缺血性腦卒中炎性機制（綜述）
    引言
    血流中斷
    細胞損傷后免疫炎癥反應(yīng)
        危險相關(guān)模式分子（Danger associated molecular pattern molecules,DAMPs）
        免疫細胞激活與炎癥因子釋放
        細胞因子與缺血損傷
        中性粒細胞浸潤與缺血性腦損傷
    總結(jié)
    參考文獻
致謝
附錄一 大動脈粥樣硬化性和小動脈閉塞性小卒中患者的早期神經(jīng)功能惡化的比較
    引言
    對象和方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻
附錄二 碩士期間科研成果
    期刊文章
    參與課題
    碩士期間所獲獎勵

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本文編號：2887442