發(fā)布時間：2018-06-05 11:16

  本文選題：亞基因復(fù)制子 + 丙型肝炎��； 參考：《中南大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的建立RNA轉(zhuǎn)染的HCV Subgenomic Replicon(HCV亞基因復(fù)制子)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達的細胞株;探討CTE-核酶對丙型肝炎病毒亞基因組RNA復(fù)制的影響。 研究方法 1.在T7體外轉(zhuǎn)錄RNA試劑盒介導(dǎo)下,將含有HCVSubgenomic Replicon的質(zhì)粒pHCV BM4-5轉(zhuǎn)化為RNA。 2.建立HCV Subgenomic Replicon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達的細胞株 在脂質(zhì)體lipofectamine ~(TM)2000介導(dǎo)下,將含有HCV SubgenomicReplicon的RNA導(dǎo)入人肝癌細胞系QSG7701中,經(jīng)G418篩選抗性克隆,擴大培養(yǎng),建立轉(zhuǎn)染克隆細胞系。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法證實HCV Subgenomic Replicon RNA復(fù)制及其蛋白表達。 3.觀察普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和CTE-核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬時轉(zhuǎn)染含HCV亞基因復(fù)制子QSG7701。48小時后收集細胞,提取細胞總RNA,采用RT-PCR方法,觀察核酶對HCV5'-NCR切割效果。 結(jié)果 1.經(jīng)RT-PCR和Western Blot證實,成功建立HCV SubgenomicReplicon RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染QSG7701細胞株。 2.經(jīng)RT-PCR證實:pPHCV5-CR1轉(zhuǎn)染組未見明顯HCV5'-NCR擴增目的條帶,pPHCV5-R1轉(zhuǎn)染組可見擴增目的條帶,亮度低于未轉(zhuǎn)染組;pPHCV5-CR2轉(zhuǎn)染組可見擴增目的條帶,亮度低于未轉(zhuǎn)染組,pPHCV5-R2轉(zhuǎn)染組可見擴增目的條帶,亮度與未轉(zhuǎn)染組接近。這些結(jié)果提示:CTE-核酶在細胞內(nèi)的切割靶RNA的效率明顯高于普通核酶。普通核酶難以切割的位點,CTE-核酶能進行有效的切割;普通核酶能進行切割的位點,帶CTE-核酶的切割效率明顯提高。 結(jié)論 1.成功建立HCV Subgenomic Replicon QSG7701細胞株。 2.CTE-核酶在細胞內(nèi)切割HCVRNA的效率明顯高于普通核酶。普通核酶難以切割的位點,CTE-核酶也能進行有效的切割;普通核酶能進行切割的位點,帶CTE-核酶的切割效率明顯提高。
[Abstract]:Objective to establish a stable transfection and expression cell line of RNA transfected HCV Subgenomic Replicon(HCV subgene replicas and to investigate the effect of CTE- ribozyme on the replication of hepatitis C virus subgenomic RNA. Research method 1. The plasmid pHCV BM4-5 containing HCVSubgenomic Replicon was transformed into HCVSubgenomic Replicon by T7 in vitro transcription RNA kit. 2. Establishment of a cell line stably transfected and expressed with HCV Subgenomic Replicon The RNA containing HCV SubgenomicReplicon was introduced into human hepatoma cell line QSG7701 by liposome lipofectamine / TMN 2000. The resistant clones were screened by G418, and the transfected clone cell line was established. HCV Subgenomic Replicon RNA replication and protein expression were confirmed by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT PCR) and Western blot. 3. After transient transfection of pPHCV5-CR1, pPHCV5-CR2, pPHCV5-CR2 and pPHCV5-R1pPHCV5-CR2 into QSG7701.48 containing HCV subgene, cells were collected and total RNAs were extracted. The effect of ribozyme on HCV5'-NCR cleavage was observed by RT-PCR method. Result 1. RT-PCR and Western Blot confirmed that the stable transfection of QSG7701 cells by HCV SubgenomicReplicon RNA was successfully established. 2. RT-PCR confirmed that there was no significant HCV5'-NCR amplification target band in the pPHCV5-CR1 transfection group. The brightness was lower than that in the untransfected pPHCV5-CR2 transfection group, and the brightness was lower than that in the pPHCV5-R2 transfection group, and the amplification target band was lower in the pPHCV5-R2 transfection group than in the non-transfected pPHCV5-R2 transfection group. The brightness was close to that of the untransfected group. These results suggest that the efficiency of cleavage target RNA of 1: CTE- ribozyme is significantly higher than that of normal ribozyme. The cleavage efficiency of CTE- ribozyme was improved when the common ribozyme was difficult to cleavage and the common ribozyme cleavage site could be effectively dissected by CTE- ribozyme. Conclusion 1. HCV Subgenomic Replicon QSG7701 cell line was successfully established. 2. The efficiency of HCVRNA cleavage by CTE- ribozyme was significantly higher than that of normal ribozyme. CTE- ribozyme which is difficult to cleavage by ordinary ribozyme can also be effectively dissected, and the cleavage efficiency of CTE- ribozyme with common ribozyme can be improved obviously because of the cleavage of common ribozyme.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R373.21

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本文編號：1981796