發(fā)布時間：2020-11-11 13:41

　　 背景與目的： 過氧化物酶體增殖物激活受體屬于核受體超家族的成員,在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：PPARαV227A基因型分布在非酒精性脂肪性肝病和健康人群中存在差異,且PPARα基因227A攜帶者(突變型)體重、體重指數(shù)、臀圍、腰圍、腰臀比、體脂含量、腹壁脂肪厚度明顯低于非227A攜帶者(野生型),因此推測PPARα基因227A攜帶者(突變型)對肥胖的發(fā)病可能是一保護(hù)性因素。為進(jìn)一步探索PPARα基因V227A變異的生物學(xué)功能,本研究擬構(gòu)建PPARαV227A野生型和突變型的真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞株,建立穩(wěn)定表達(dá)PPARα-EGFP融合蛋白的細(xì)胞模型；探討PPARαV227A變異在肝細(xì)胞中的生物學(xué)作用及其相關(guān)機(jī)制。 方法： 設(shè)計帶有突變堿基的引物,通過融合PCR引入突變堿基,獲取PPARαV227和227A的全長基因,再將野生型和突變型的PPARα基因插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建pEGFP-N1-PPARαV227A重組質(zhì)粒。經(jīng)測序驗證、確定所擴(kuò)增的DNA序列為PPARα基因。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PPARαV227、pEGFP-N1-PPARα227A和空質(zhì)粒pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞株,經(jīng)G418篩選出陽性克隆,用熒光倒置顯微鏡、Western blOt證實(shí)PPARα-EGFP融合蛋白在L02肝細(xì)胞中的表達(dá)。并將L02肝細(xì)胞分成四組：pEGFP-N1-PPARαV227組(野生組)、pEGFP-N1-PPARα227A組(突變組)pEGFP-N1組(空載體組)和對照組；每組再分為PPARα激動劑WY14643干預(yù)組和WY14643不干預(yù)組,分別采用MTT技術(shù)檢測細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡,并用Western blOt檢測PPARα作用相關(guān)通路蛋白及信號分子的表達(dá)變化。 結(jié)果： (1)成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-PPARαV227(野生型)和pEGFP-N1-PPARα227A(突變型)； (2)獲得了穩(wěn)定表達(dá)PPARαV227-EGFP(野生型)和PPARα227A-EGFP(突變型)融合蛋白的L02細(xì)胞株； (3) MTT結(jié)果顯示：野生組細(xì)胞生長較為緩慢,與突變組細(xì)胞相比,野生組細(xì)胞存活率明顯降低(P0.01)。 (4)流式細(xì)胞術(shù)Annexin V與PI雙染色結(jié)果顯示：野生組細(xì)胞凋亡率較高,與突變組細(xì)胞相比,野生組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P0.01)。 (5) Western blot結(jié)果顯示：野生組和突變組肝細(xì)胞PPARα、RXRα蛋白的表達(dá)無明顯差異；PPARα激動劑WY14643可誘導(dǎo)PPARα、RXRα蛋白的表達(dá)； (6)突變組肝細(xì)胞p44/42MAPK (Thr202/Tyr204)磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯高于野生組；NF-KB-p65 (Ser536)磷酸化蛋白的表達(dá)水平低于野生組。 結(jié)論： (1)構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-PPARαV227(野生型)和pEGFP-N1-PPARα227A (突變型)； (2)獲得了穩(wěn)定表達(dá)PPARαV227-EGFP (野生型)和PPARα227A-EGFP(突變型)融合蛋白的L02細(xì)胞株； (3) PPARα227A (突變型)細(xì)胞存活率高于PPARαV227 (野生型),而凋亡率低于PPARαV227(野生型)； (4) PPARα227A(突變型)可能較PPARαV227 (野生型)有更高的活性,并可能通過增加P44/42MAPK (Thr202/Tyr204)磷酸化蛋白的表達(dá)及抑制NF-κB-p65 (Ser536)磷酸化蛋白的表達(dá)而影響L02細(xì)胞的增殖與凋亡。 該研究結(jié)果為PPARαV227A變異在肝細(xì)胞中的生物學(xué)作用提供了重要的參考價值,但是PPARαV227A野生型和突變型在細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)具體如何發(fā)揮作用仍不明確,有待于在今后的研究工作中做深入的探索。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R575.5
【文章目錄】：
致謝
序言
摘要
ABSTRACT
縮略語表
插圖和附表清單
目次
1 緒論
    1.1 研究背景
    1.2 研究內(nèi)容
2 pEGFP-N1-PPARα V227A真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
    2.3 結(jié)果
    2.4 討論
    小結(jié)
3 pEGFP-N1-PPARα V227A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染L02胞
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
    3.3 結(jié)果
    3.4 討論
    小結(jié)
4 PPARα基因V227A變異對肝細(xì)胞增殖與凋亡的影響
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
    4.3 結(jié)果
    4.4 討論
    小結(jié)
5 PPARα基因V227A變異影響肝細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
    5.3 結(jié)果
    5.4 討論
    小結(jié)
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡歷及在學(xué)期間主持課題和發(fā)表論文

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;中國成人血脂異常防治指南[J];中華心血管病雜志;2007年05期

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本文編號：2879252