發(fā)布時間：2021-03-18 22:43

  背景和目的： 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已經成為全球發(fā)病率最高的致死性心臟疾病，其病理變化往往是在冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化的基礎上繼發(fā)急性血栓，致使冠狀動脈血供急劇減少甚至血流中斷，造成相應的供血心肌持久而嚴重地急性缺血，從而引起大量心肌細胞死亡。目前，臨床上廣泛開展的經皮冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）能夠快速恢復急性缺血心肌的血液灌注，最大程度地挽救瀕臨死亡的心肌細胞，是限制心肌梗死面積、改善患者預后的關鍵，也已成為急性心肌梗死的最佳治療策略。但是，在急性心梗的搶救和治療過程中，罪犯血管重新恢復血液供應后，過量的自由基等攻擊重新獲得血液供應的這部分組織內的細胞，會造成進一步的再灌注損傷，臨床表現為：心肌頓抑、再灌注性心律失常、微循環(huán)障礙及致死性再灌注損傷。這些損傷會導致左心室收縮功能減弱、左室內壓降低等心肌功能的抑制。 目前，缺血再灌注損傷的機制尚未完全明確。已有眾多學者分別進行了大量的動物實驗和臨床研究，許多研究均從不同方面減輕了再灌注損傷，得出了令人鼓舞的結論，另外，分子水平領域的相關機制研究仍在繼續(xù)，這也將有助于人們發(fā)現新的缺血再灌注保護介質。 促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由缺氧誘導因子家族誘導產生的多功能細胞因子超家族成員。氨甲酰化促紅細胞生成素(carbamylatederythropoietin，CEPO)是促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)的一種衍生物。EPO和CEPO通過調節(jié)炎癥、抗凋亡、促血管生成、保護神經細胞、刺激心肌細胞增殖分化在心、腦組織缺血缺氧時起到了重要的保護作用。除了經典的造血功能以外，EPO和CEPO對整個生物體穩(wěn)態(tài)的維持也發(fā)揮著重要的作用。EPO作為一種促血管生成因子，直接參與創(chuàng)傷愈合、月經周期、炎癥、腫瘤、視網膜病變等生理性和病理性新生血管形成，并且具有與血管內皮生長因子相當的效應。EPO直接或通過調節(jié)細胞周期蛋白促進內皮細胞增殖，保護內皮細胞的完整性。EPO與其受體結合可以促進新生血管形成。作為EPO的新一代高效能衍生物，CEPO對內皮細胞的作用如何是本課題研究的主要內容。 目前關于CEPO的相關研究仍然較局限于動物試驗領域，在急性心肌梗死PCI術后即心肌缺血再灌注損傷病人中的應用鮮有報道，利用此類患者的血清攻擊血管內皮細胞造成細胞損傷模型的研究尚不多見。因此，本實驗選取人臍靜脈內皮細胞做為研究對象，在體外培養(yǎng)中充分模擬臨床病理生理過程，采用血清藥理學的方法建立細胞損傷模型，從而觀察CEPO的保護作用，并對其信號轉導機制進行了初步探討。 方法： 本研究以ECV340內皮細胞作為研究對象，分別給予以PCI手術后12h、24h、48h和72h的患者血清，選取對數生長期的細胞，用血清分別作用24h和48h，采用TUNEL法觀察細胞凋亡率，流式細胞儀觀察細胞周期，放免法測定NO含量和NOS活性，ELISA法檢測IL-1、IL-6等炎癥因子含量，篩選PCI術后血管內皮細胞損傷的高峰時間和細胞作用時間。后加入不同濃度的EPO（100IU/ml、50IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、1IU/ml）和不同濃度的CEPO（100IU/ml、50IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、1IU/ml)。采用TUNEL法觀察細胞凋亡率，流式細胞儀觀察細胞周期，放免法測定NO含量和NOS活性，ELISA法檢測IL-1、IL-6等炎癥因子含量，篩選EPO及CEPO對PCI術后患者血清致ECV304細胞損傷的保護作用最佳濃度。EPO和CEPO對ECV304細胞損傷保護作用機制的研究則以生化法檢測EPO和CEPO對LDH泄漏率的影響； Westernblotting analysis檢測JAK2及其磷酸化蛋白含量；免疫組化法分別檢測內皮細胞中pERK、pJNK、pP38的含量。 結果： 1、與陰性對照組相比，分別用PCI術后12h、24h、48h和72h患者血清處理ECV304細胞24h和48h后，凋亡率非常顯著性增加（P0.01）；G0/G1期、G2/M期細胞所占比例顯著降低，S期G2/M期增加（P0.05或P0.01）。 2、與陰性對照組相比，分別用PCI術后12h、24h、48h和72h患者血清處理ECV304細胞24h和48h后，，NO含量顯著降低，NOS活性顯著減弱（P0.05或P0.01），IL-1和IL-6含量均非常顯著增加（P0.01），以48h患者血清處理ECV304細胞24h后，效果最為顯著。 3、與空白對照組相比，采用1IU/ml-100IU/ml EPO給藥后，吸光度值均非常顯著性增加（P0.01），其中以50IU/ml EPO效果最為顯著。 4、采用I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO給藥后，細胞凋亡率顯著降低（P0.05或P0.01））；采用20I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO給藥后，S期細胞所占比例顯著降低（P0.05或P0.01），采用50U/ml CEPO給藥后G2/M期降低（P0.01）。 5、采用I0U/ml-100IU/ml EPO或CEPO給藥后，NO和NOS含量顯著增加（P0.05或P0.01）），IL-1和IL-6顯著降低（P0.05或P0.01）），其中以CEPO20IU/ml及EPO50IU/ml效果最為顯著。 6、與模型組相比，采用50IU/ml EPO或20IU/ml CEPO給藥后，LDH泄漏率非常顯著性降低（P0.01）。 7、與模型組相比，JAK2和P-JAK2的表達水平明顯降低。 8、與模型組相比，EPO及CEPO處理后pERK、pJNK、pP38的陽性表達水平顯著降低（P0.01）。 結論： 1、用PCI術后12h、24h、48h和72h患者血清處理ECV304細胞可成功建立經PCI術后患者血清誘導的人血管內皮細胞損傷模型； 2、48h患者血清處理ECV304細胞24h后細胞凋亡最為顯著，內皮損傷最為明顯； 3、EPO處理ECV304細胞24h后，可促進正常細胞的增殖，以EPO50IU/ml效果最為顯著；而CEPO并不促進正常內皮細胞增殖； 4、CEPO也可有效緩解PCI術后患者血清造成的細胞損傷，以CEPO20IU/ml效果最為顯著； 5、CEPO可降低內皮細胞凋亡指數，顯著增加NO和NOS含量，顯著降低IL-1和IL-6； 6、CEPO可降低JAK2及p-JAK2表達，提示CEPO可通過調控JAK2/STAT5信號通路發(fā)揮心血管保護作用；CEPO可降低pERK、pJNK、pP38表達，提示CEPO可通過調控MAPK信號通路發(fā)揮心血管保護作用。



本文編號：1715713