發(fā)布時間：2018-07-13 16:47

【摘要】：目的:感染瘧原蟲的紅細胞會特異性表達生成新滲透性通道(NPPs),并在紅細胞膜上過表達膽堿轉運載體(ECCs)�；�于此,本課題以膽堿-聚乙二醇衍生物(CD-PEG-SA)為修飾分子,構建粒徑80 nm的膽堿-聚乙二醇雙修飾蒿甲醚脂質納米粒(CD-PEG-ARM-NLC),以期靶向紅細胞膜上的NPP通道和ECC載體,達到長循環(huán)和靶向抗瘧的作用。制備并表征CD-PEG-ARM-NLC;考察其對約氏瘧原蟲(Py BY265)、惡性瘧原蟲(Pf3D7)的體內外抗瘧活性;并通過包載熒光探針香豆素-6研究CD-PEG-NLC對感染紅細胞的靶向性。方法:1.CD-PEG-ARM-NLC的處方工藝考察在前期工藝研究基礎上,采用高壓乳勻法制備CD-PEG-ARM-NLC,通過對CD-PEG-SA的加入方式、用量進行單因素考察,優(yōu)化制備處方。2.CD-PEG-ARM-NLC的質量表征對CD-PEG-ARM-NLC的形狀、粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等理化性質進行表征,考察藥物的體外釋放特性,并進行體外溶血試驗。3.CD-PEG-ARM-NLC的體外抗瘧活性評價通過明膠沉降法從常規(guī)培養(yǎng)的Pf3D7中分離得到有/無knob結構的Pf3D7,以ARM為陽性對照,采用常規(guī)培養(yǎng)的、有/無knob結構的Pf3D7,應用SYBR Green I法,考察不同濃度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC對瘧原蟲增殖的抑制作用,以藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)為指標考察其體外抗瘧活性。4.CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察以香豆素-6(C6)為熒光探針,C6溶液為陽性對照,高壓乳勻法制備C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。將熒光納米粒分別與體外培養(yǎng)的Pf3D7感染的紅細胞、在體Py BY265感染的瘧鼠紅細胞孵育,熒光顯微鏡下觀察熒光分布和強度。通過NPP通道和ECC載體抑制試驗,比較不同納米粒組的熒光亮度,分析NPP通道和ECC載體對納米粒進入感染紅細胞的影響。5.CD-PEG-ARM-NLC的體內藥效學研究采用約氏瘧原蟲BY265感染小鼠模型,以溶劑組、三種空白納米粒組,不治療(空白)組為陰性對照,以ARM組為陽性對照,通過四天抑制試驗和28天治愈試驗考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三種納米粒的抗瘧活性。結果:1.CD-PEG-ARM-NLC考察后處方CD-PEG-SA的加入方式為外加乙醇法,加入量為m膽堿/m混脂=19.24%(g/g)。考察后的處方組成為:GMS 1.9286 g,MCT 1.0714 g,RH40 1.2 g,ARM 0.768 g,CD-PEG-SA 0.5772 g,去離子水100 ml。2.CD-PEG-ARM-NLC的質量表征CD-PEG-ARM-NLC是均一、略帶藍色乳光的半透明液體制劑,透射電鏡結果顯示納米粒呈類球形,粒徑分布均勻;測定平均粒徑為65.10±0.64 nm,多分散系數(shù)為0.186±0.004;Zeta電位為-24.47±1.01 m V;包封率為87.03%±0.71%;載藥量為11.62%±0.10%;在p H 7.4的磷酸鹽緩沖液中72 h內體外累積釋放率為81.95%±0.85%,釋藥規(guī)律符合Weibull方程,t50為10.36 h;體外溶血試驗無紅細胞聚集及溶血現(xiàn)象。3.CD-PEG-ARM-NLC的體外抗瘧活性評價SYBR Green I法測得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC對常規(guī)培養(yǎng)的Pf3D7的IC50值分別為4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05nmol/L;對有knob結構的Pf3D7的IC50值分別為4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L;對無knob結構的Pf3D7的IC50值分別為4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。4.CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察熒光顯微鏡觀察結果顯示,納米�；�本不進入正常紅細胞,但可進入感染紅細胞,且能聚集于瘧原蟲周圍,而不是彌散于整個紅細胞;CD-PEG-C6-NLC組的熒光強度高于C6-NLC組和PEG-C6-NLC組;以上結果顯示CD-PEG-C6-NLC對感染紅細胞有靶向作用。加入NPP抑制劑(呋塞米)可基本阻斷C6-NLC和PEG-C6-NLC進入感染紅細胞,但CD-PEG-C6-NLC仍可進入感染紅細胞;同時加入NPP抑制劑(呋塞米)和ECC天然底物(膽堿)方能基本阻斷紅細胞對CD-PEG-C6-NLC的攝取。5.CD-PEG-ARM-NLC的體內藥效學研究陽性對照組ARM尾靜脈注射的ED50值為0.266 mg/(kg·day),ED90值為0.945mg/(kg·day),ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分別為0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day),ED90值分別為0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day),表明ARM制成納米粒后抗瘧活性有一定的提高。結論:采用優(yōu)化后處方制備CD-PEG-ARM-NLC,其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、體外釋放特性和溶血試驗等指標均符合預期要求;體內外藥效實驗均說明CD-PEG-ARM-NLC比ARM、ARM-NLC和PEG-ARM-NLC有更好的抗瘧活性;靶向試驗初步結果表明CD-PEG-C6-NLC對感染紅細胞有靶向作用,更深入的驗證有待后續(xù)實驗。
[Abstract]:Objective : To study the effect of CD - PEG - ARM - NLC on the growth of Plasmodium falciparum . The anti - malaria activity of three nanoparticles of ARM - NLC , PEG - ARM - NLC , CD - PEG - ARM - NLC was investigated by four - day inhibition test and 28 - day inhibition test . The IC50 values of CD - PEG - ARM - NLC were 4.28 鹵 0 . 06 , 3.93 鹵 0.03 , 3.58 鹵 0.08 , 3.01 鹵 0.05 nmol / L respectively . The IC50 values of the CD - PEG - ARM - NLC were 4.27 鹵 0.06 , 3.34 鹵 0.07 , 2.81 鹵 0.08 , 2.12 鹵 0.09 nmol / L respectively . The results showed that CD - PEG - C6 - NLC had better anti - malaria activity than ARM , ARM - NLC and PEG - ARM - NLC . The results showed that CD - PEG - ARM - NLC had better anti - malaria activity than ARM , ARM - NLC and PEG - ARM - NLC . The results showed that CD - PEG - C6 - NLC had a better anti - malaria activity than ARM , ARM - NLC and PEG - ARM - NLC .
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R943

【參考文獻】

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本文編號：2120082