金黃色葡萄球菌是一種致病力及致死率都很高的革蘭氏陽性菌,它能在抗生素環(huán)境下快速突變?yōu)槟退幗瘘S色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA),近年來幾乎所有上市抗生素都出現(xiàn)了相應的MRSA菌。為了緩解抗生素耐藥造成的公眾健康危機,開發(fā)一類有別于傳統(tǒng)抗生素的新型治療策略尤其迫切。細菌在生長和繁殖過程中會分泌出各種毒力因子,這些毒力因子不僅能隨宿主環(huán)境變化進行自適性調(diào)節(jié),為細菌營造出更適宜的生長環(huán)境,而且能夠幫助細菌躲避宿主的免疫殺傷,更重要的是毒力因子不直接影響細菌的生長和繁殖。因此以毒力因子為靶點的新型抗細菌感染治療策略,能夠在“不殺菌”的前提下降低細菌對人體的傷害,并有效避免細菌的耐藥性突變。金黃色色素是金黃色葡萄球菌體內(nèi)特有的毒力因子,不僅能夠幫助細菌抵御人體的免疫殺傷(ROS殺傷機制),還會加速人體器官和組織的壞死,因此通過阻斷金黃色色素的合成和產(chǎn)生,能高效專一的治療MRSA引起的感染和損傷。金黃色色素的合成通路受操縱子crtOPQMN調(diào)控,CrtN是其中最重要的色素合成通路之一。在課題組之前的研究中,我們通過自建“老藥庫”發(fā)現(xiàn)了已上市抗真菌藥物鹽酸萘替芬,能通過靶向CrtN來阻斷金黃色色素的合成。我們以鹽酸萘替芬為先導化合物,將其結(jié)構(gòu)中的萘環(huán)替換成苯并脂肪環(huán),發(fā)展了第一代靶向CrtN的苯并脂肪環(huán)類色素抑制劑,特別是候選藥物44表現(xiàn)出了極佳的體內(nèi)外藥效。但是在隨后的研究中,我們發(fā)現(xiàn)候選藥物44存在水溶性差,心臟hERG毒性強等成藥性缺陷。因此,本論文工作的主要目標就是發(fā)現(xiàn)一類具有良好體內(nèi)外活性,同時能夠克服第一代色素抑制劑缺陷的新型藥物小分子。我們首先以同是苯并脂肪環(huán)衍生物的46為先導化合物,分析了化合物水溶性差的主要根源在于結(jié)構(gòu)中存在疏水性苯并脂肪環(huán),并驗證性在46的結(jié)構(gòu)中插入了一個親水性氧原子,合成了具有苯并二氫吡喃新骨架衍生物60。60不僅保持了較好的色素抑制活性(IC50 = 4.6±0.2nM),同時水溶性比46提高了20多倍(13.2 mg/mL)。隨后以苯并二氫吡喃為母核結(jié)構(gòu),在新化合物60的其他結(jié)構(gòu)區(qū)域進行優(yōu)化和改造,在保持其色素抑制活性和水溶性的基礎上,改善心臟hERG毒性。在先導化合物46的烯丙基碳端位(A區(qū)域)引入環(huán)烷基、取代芳基及雜芳基等,設計合成了38個新衍生物(47-84),并考察它們對S.aureusNewman的色素抑制能力。測試結(jié)果不僅清晰的展示了化合物結(jié)構(gòu)與抑制活性之間的關系,而且發(fā)現(xiàn)了 9個化合物的色素抑制活性達到了個位數(shù)納摩爾級別,通過構(gòu)效關系結(jié)果對化合物進行初步篩選后,4-二苯基取代基片段的化合物67表現(xiàn)出了最強的色素抑制活性(IC50 = 3.8±0.1nM)。隨后將烯烴端位碳取代固定為對二苯基取代片段,開展了氮上(R)和鏈上取代變化(Linker)的考察。對這兩部分的考察共合成了 10個化合物(85-94),根據(jù)色素抑制結(jié)果可知,氮上甲基被替換成氫原子、乙基或異丙基后(85-87),色素抑制活性喪失,鏈上雙鍵被替換或剔除(89-93)也會喪失色素抑制活性,而引入共軛多烯基團后,色素抑制活性反而有所上升。色素抑制活性較好的衍生物53、56、57、58、59、60、63、66、67、81、88、94被優(yōu)選進行水溶性和心臟hERG毒性方面的篩選,化合物67和88憑借出色的色素抑制活性、較低的hERG毒性和良好的水溶性,被選中進行隨后的藥理篩選實驗。在CrtN酶抑制活性試驗中,兩個化合物均表現(xiàn)出較好的酶抑制活性(IC50300nM)。在MRSA菌株色素抑制試驗中,四組MRSA菌,USA400MW2、USA300 LAC、Mu50和NRS271菌株被用來考察化合物的色素抑制活性,結(jié)果顯示67和88均表現(xiàn)出良好的MRSA色素抑制活性,但候選藥物88在Mu50和NRS271菌株中的表現(xiàn)更佳(IC50 = 0.36±0.1 nM inMu50和IC50=0.4±0.1 nMinNRS271),我們將更有成藥潛質(zhì)的88作為候選藥物開始進一步的考察。利用高效液相色譜法測定CrtM的催化產(chǎn)物,證明了候選藥物88確實作用在CrtN色素合成通路。隨后設置了四種不同的體外實驗,詳細考察與候選藥物88共孵育的MRSA菌在免疫清除上的變化,綜合各實驗結(jié)果可知,候選藥物88能夠在“不殺菌”的情況下,極大的削弱了細菌的毒力和繁殖能力。鑒于第一代色素抑制體內(nèi)藥效評價中存在的缺陷,在本論文工作中,通過增加多種多重耐藥MRSA菌株為受試菌、引入萬古霉素和利奈唑胺作為陽性對照物、增加了對給藥劑量(0.1mgb.i.d.和0.4mgb.i.d.)和給藥模式(前給藥模式和正常給藥模式)的考察,全面評價了候選藥物88的體內(nèi)抗毒活性。實驗結(jié)果表明候選藥物88在S.aureus Newman菌株、中度萬古霉素耐藥MRSA菌株Mu50和重度利奈唑胺耐藥MRSA菌株NRS271的小鼠感染膿腫實驗中均表現(xiàn)出較好的治療效果,甚至小劑量給藥組表現(xiàn)出好于陽性藥組的抑菌能力(部分臟器中抑菌率達到了99%)。為了進一步提高化合物水溶性,對88進行了鹽型篩選,合成了 10類不同的鹽型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)88磷酸鹽具有較好的水溶性(12.9 mg/mL)。以上實驗結(jié)果都證明候選藥物88可以作為抗毒力因子候選藥物進行后續(xù)開發(fā)。在苯并二氫吡喃類衍生物設計中,通過在苯并脂肪環(huán)結(jié)構(gòu)中引入親水性氧原子,顯著提高了化合物的水溶性,但是比較遺憾的是,由于在結(jié)構(gòu)優(yōu)化中引入了疏水的4-二苯基和共軛雙烯,雖極大地改善了hERG毒性,但同時消泯了親水性氧原子帶來的水溶性提升。在本論文的第二部分工作中,為了進一步改善化合物水溶性,同時拓展第二代靶向CrtN金黃色色素抑制劑的骨架類型,我們再次以46為先導化合物,在苯并脂肪環(huán)結(jié)構(gòu)中引入兩個氧原子,設計并合成一類新穎的,具有苯并二噁烷骨架的化合物。苯并二噁烷候選藥物的研究策略和發(fā)現(xiàn)過程與第一部分工作相同,共有46個新結(jié)構(gòu)衍生物被合成并測試了S.aureus Newman色素抑制活性,其中有11個位數(shù)納摩爾抑制活性的化合物被獲得。通過構(gòu)效關系結(jié)果篩選,活性較好的A05、A06、A37、A38(ICs03.5nM)被選取測試水溶性、心臟hERG毒性、體外酶活和其他MRSA菌色素抑制活性,候選藥物A37在其中表現(xiàn)出最好的成藥潛力,并進行了體外“不殺菌”免疫清除實驗,實驗結(jié)果可知,A37在“不殺菌”的前提下,高效的削弱了細菌在免疫環(huán)境下的存活能力。在體內(nèi)藥效實驗中,候選藥物A37依舊表現(xiàn)出色,實驗結(jié)果顯示大部分A37給藥組顯示出了良好的體內(nèi)藥效活性,小劑量給藥組的體內(nèi)活性好于提前給藥組,甚至小劑量正常給藥組活性和兩個陽性藥組相當。所有這些數(shù)據(jù)都表明候選藥物A37是極具潛力的抗MRSA,VISA和LRSA感染的候選藥物。本論文工作的創(chuàng)新性主要表現(xiàn)在以下3個方面:(1)在苯并脂肪環(huán)中引入親水性氧原子,形成具有苯并二氫吡喃和苯并二噁烷骨架的第二代靶向CrtN金黃色葡萄球菌色素抑制劑;(2)克服了苯并脂肪環(huán)類色素抑制劑的缺陷,提升了候選藥物的水溶性和改善了心臟hERG毒性;(3)優(yōu)化了體內(nèi)藥效學評價模型,引入多重耐藥菌株作為受試菌株,同時增加萬古霉素和利奈唑胺為陽性藥對照組。
【學位單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：
讓抗生素得以在全世界廣泛使用［２（）］。隨之而來的抗生素濫用，特別是在畜牧業(yè)和食品工??業(yè)中問題尤為嚴重，更加劇了“危機”的進一步惡化［２１，２２］。而且更令人擔憂的是，新型抗??生素的研發(fā)進展也越來越跟不上細菌對抗生素耐藥的進化速度。由圖１．１可見［２３］，１９７０??
抗生素耐藥時間線?ｍ＇??圖１．１抗生素的研發(fā)及耐藥時間軸（軸上方為各類抗生素的研發(fā)時間，軸下方為各類抗生素耐??藥菌的出現(xiàn)時間，圖片改自參考文獻丨２３１）。??Ｆｉｇ．?１．１?Ｔｈｅ?ｔｉｍｅｌｉｎｅ?ｏｆ?ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ?ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ?（ａｂｏｖｅ）?ａｎｄ?ｔｈｅ?ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ?ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ??（ｂｅｌｏｗ）．??自上世紀８０年代起，藥物研發(fā)成本的升高、藥物新型治療策略陷入瓶頸及藥物上市??后資金收益極度縮水，導致世界主要的藥物研發(fā)企業(yè)大幅縮減對新型抗菌藥物開發(fā)的投??入。特別是２０００以后，上市的新抗菌藥物逐年遞減，特別是近幾年這種趨勢愈演愈烈，??２０１５年至２０１７年僅有四個上市新藥，其中更有兩個僅是聯(lián)合用藥型新藥，而在２０１６年更??是“顆粒無收”（表１．１）?［２８’２９］。截止２０１７年，新千年后上市的化學類抗菌藥物總計３４個，??全部是針對細菌本身殺傷的傳統(tǒng)廣譜性抗生素（表１．１），沒有一例以新機制新治療策略??成功上市的藥物。??表１．１?２０００－２０１７年ＦＤＡ批準上市的化學類抗菌藥物匯總（表格改自參考文獻［２８］）??Ｔａｂｌｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｓｕｍｍａｒｙ?ｏｆ?ＦＤＡ?ａｐｐｒｏｖｅｄ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｄｒｕｇ?ｄｕｒｉｎｇ?２０００－２０１７??上市年份?藥物名稱?
ＭＬＳ類抗生素（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ－ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ－ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎｓ）包括大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺??類和鏈陽菌素類抗生素，通過阻斷核糖體中５０ｓ轉(zhuǎn)移酶，抑制細菌蛋白合成，達到阻止??細菌繁殖的目的（圖１．４）?［７４，７５］。ｍＬＳ類抗生素耐藥機理主要有三種：（１）藥物主動外??排機制介導的耐藥性突變，通過操縱子調(diào)控ＡＴＰ泵，使抗生素主動流出胞外，降低??胞內(nèi)藥物濃度，并使藥物與核糖體結(jié)合的能力下降，喪失藥效［７Ｍ８］；?（２）通過調(diào)控ｅｒｍＡ、??ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ，介導２３ＳｒＲＮＡ甲基化酶發(fā)生改變，或使核糖體結(jié)合藥物的作用位點發(fā)生??改變，降低甚至阻斷藥物的殺菌能力，以達到耐藥的目的［７９，８ｔ）］；?（３）直接通過體內(nèi)的??代謝酶破壞藥物活性結(jié)構(gòu)，使藥物失活［８１］。??氨基糖甙類抗生素（Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）因為其副作用比較大，現(xiàn)已逐漸退出市場，??少數(shù)藥物如妥布霉素等也只作為局部用藥使用。其耐藥模式基本和ＭＬＳ類抗生素相同，??
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本文編號：
2864528
