發(fā)布時間：2020-11-12 08:28

　　 抗生素濫用導致細菌和真菌耐藥性成為不可忽視的問題�？咕�肽由于其獨特作用機制,細菌和真菌不易對其產(chǎn)生耐藥性,具有開發(fā)成新型抗生素的潛力。但是天然抗菌肽往往存在活性不高、提取過程復雜等不足,限制了抗菌肽的開發(fā)應用。人工設計多肽是獲取新型抗菌肽的一種有效途徑。本研究從實驗室開發(fā)的抗菌肽庫設計軟件V1.0設計獲得的肽庫中隨機挑選100條多肽序列,進行固相合成。通過抑菌實驗測試了100條多肽的抗菌活性,從中篩選出一條廣譜高抑菌活性的抗菌肽,將其命名為SAMP1。對抗菌肽SAMP1進行結構優(yōu)化,篩選到更加高效低毒的抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4。抑菌實驗結果顯示,抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4對熱帶念珠菌的最小抑菌濃度均為3.9μg·mL~(-1),對單增李斯特菌的最小抑菌濃度分別是3.9μg·mL~(-1)和0.95μg·mL~(-1)。溶血實驗結果顯示,當SAMP1-A3和SAMP1-A4濃度為62.5μg·mL~(-1)時,引起溶血率分別為0%和2.7%。細胞毒性實驗結果顯示,當SAMP1-A3和SAMP1-A4在40×MIC濃度下處理24h后,并未造成HUVEC細胞死亡。濃度在125μg·mL~(-1)以下時,SKOV3細胞生長不受影響,說明抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4對哺乳動物細胞沒有毒性。因此,SAMP1-A3和SAMP1-A4是抗菌活性強、生物安全性高的抗菌肽。穩(wěn)定性實驗結果表明:SAMP1-A3和SAMP1-A4在80℃下加熱30min抑菌活性不變,在pH2.0~8.0范圍內(nèi)處理1h后活性不變,25%血漿處理6h后抑菌活性不變,但對胰蛋白酶敏感。圓二色譜結果顯示,在50%體積分數(shù)的TFE溶液中,SAMP1-A3和SAMP1-A4的α-螺旋比例增加。利用掃描電鏡、透射電鏡和流式細胞術實驗研究抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4的作用機制。發(fā)現(xiàn)抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4引起熱帶念珠菌和單增李斯特菌細胞膜破裂,內(nèi)容物泄露致使病原菌死亡;抗菌肽SAMP1-A4可以破壞單增李斯特菌細胞器結構,細胞膜形成損傷。綜上所述,本研究獲得了到兩條高效低毒且具有較高穩(wěn)定性的抗菌肽SAMP1-A3和SAMP1-A4,并證明其通過破壞病原菌細胞膜完整性而發(fā)揮抗菌作用。
【學位單位】：河南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

第三章 結果與分析×MIC（3.9μg·mL-1）濃度的 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 的 SD 培養(yǎng)基中，測試線。結果如圖 3-1 所示，在 1×MIC 濃度下，兩種抗菌肽發(fā)揮抗菌作用過程具賴性，在作用 1 h 后抗菌速率提升，在 4 h 內(nèi)使熱帶念珠菌完全死亡，所以兩對熱帶念珠菌都具有殺菌作用。

圖 3-2 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 處理后單增李斯特菌生長曲線ig.3-2 Growth curve of L.monocytogenes post-treatment of SAMP1-A3 and SAMP1-AAMP1 及其類似肽的溶血毒性了評估肽對哺乳動物細胞的細胞毒性，在不同肽濃度下測定了對人類紅細胞分比（表 3-3）。結果顯示，經(jīng)過序列重排后正電荷氨基酸殘基聚集在 C 端的AMP1-A1 和正電荷氨基酸殘基均勻分布的類似肽 SAMP1-A2 溶血毒性升高荷氨基酸殘基聚集在 N 端的類似肽 SAMP1-A3 溶血毒性降低。用 Arg 替換類似肽 SAMP1-A4 與抗菌肽 SAMP1 相比溶血毒性降低。用 Val 作為疏水性基的類似肽 SAMP1-A7 溶血性降低，而用 Trp 作為疏水性氨基酸殘基的序-A8 顯示出溶血毒性增加，表明序列中加入色氨酸殘基可能會引起人紅細胞

圖 3-3 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 處理后 HUVEC 細胞形態(tài)Fig. 3-3 HUVEC cell morphology after treatment with SAMP1-A3 and SAMP1-A4.6.2 對 SKOV3 卵巢癌細胞的毒性目前已見報道的抗菌肽，不僅具有廣譜抑菌活性，還對癌細胞具有殺滅作用，具開發(fā)成新型抗癌藥物的巨大潛力。使用 MTT 法測定不同濃度的抗菌肽 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 對 SKOV3 卵巢癌胞的生長抑制情況，評估兩種抗菌肽的抗癌作用。結果如圖 3-4 所示，SAMP1-A3 SAMP1-A4 對 SKOV3 卵巢癌細胞殺傷作用并不明顯，當多肽濃度高達 3000μg·mL-1，SKOV3 卵巢癌細胞存活率仍為 67%和 75.6%。當多肽濃度在 125μg·mL-1以下時，細胞生長完全不受影響。由此可見，雖然 SAMP1-A3 和 SAMP1-A4 對真菌和細菌有高效抑菌活性，但對癌細胞的生長抑制作用并不大。
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本文編號：2880518