發(fā)布時間：2025-04-26 21:48

　　α-酮纈氨酸（KIV）是生物合成中的重要中間體,廣泛應用于食品、飼料、醫(yī)藥和化學合成等行業(yè)。目前,KIV可通過化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉化法合成�；瘜W法合成KIV步驟多,且需要苛刻的生產(chǎn)條件。微生物發(fā)酵法存在發(fā)酵周期長、產(chǎn)量低等缺點。相比而言,酶轉化法具有底物轉化率高、產(chǎn)量高、產(chǎn)物易分離、環(huán)境污染小等優(yōu)點,適合KIV的生產(chǎn)。本研究以大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）為宿主,對來源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶（PmLAAD）進行異源表達,從而構建了重組菌株E.coli BL21（pET-28a-Pm LAAD）,利用該酶催化底物L-纈氨酸（L-Val）合成產(chǎn)物KIV,并利用蛋白質工程改造、菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化、全細胞轉化條件優(yōu)化以及罐上轉化條件優(yōu)化等手段進一步提高了L-氨基酸脫氨酶合成KIV的效率,論文主要內(nèi)容如下:（1）成功構建了含有L-氨基酸脫氨酶基因的重組大腸桿菌E.coli BL21（pET-28a-PmLAAD）,該基因來源于P.mirabilis。利用重組菌株催化底物L-Val制備KIV,評估結果表明,當?shù)孜餄舛瘸�過20 g·...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2海因法合成α-酮纈氨酸

化學合成法生產(chǎn)α-酮酸最為常用,它又可具體細分為:酰基氰化物水解法,氧化法,格氏試劑法,海因法等[7]。在這些化學合成法中,KIV生產(chǎn)最常用的化學合成法是格氏試劑法和海因法。格氏試劑法是以草酸二乙酯和格氏試劑為反應起始化合物,且反應需在乙醚中進行。該反應步驟少,產(chǎn)品得率高。但是需....

圖1-3具有脫氨或者轉氨功能的四種酶

與前兩種生產(chǎn)方法相比,酶轉化法生產(chǎn)KIV是一種綠色、經(jīng)濟、高效的生產(chǎn)方式。這種生產(chǎn)方式一般具有底物單一,底物轉化率和生產(chǎn)強度高,反應時間較短,反應步驟較少等優(yōu)點。因此,酶轉化法生產(chǎn)化學品在近年來獲得了廣泛的關注和發(fā)展。酶轉化法是以L-Val為底物,通過脫氨基作用或者轉氨基作用制備....

圖3-1 Pm LAAD經(jīng)誘導表達后的SDS-PAGE圖

為了驗證構建的L-氨基酸脫氨酶基因重組菌是否在大腸桿菌中成功表達了LAAD,對該菌株進行了誘導表達。將重組菌pET-28a-PmLAAD在LB中進行過夜培養(yǎng)后,以2%的接種量轉接入TB培養(yǎng)基中,在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6,添加0.4mmol·L-1的IPTG誘導1....

圖3-2底物濃度對制備KIV的影響

為了考察L-氨基酸脫氨酶重組菌pET-28a-PmLAAD催化L-Val制備KIV的能力,在25oC,pH8.0和10g·L-1全細胞催化劑的條件下,研究了不同底物濃度對轉化反應的影響。結果如圖3-2所示,當?shù)孜餄舛葟?0g·L-1增加至60g·L-1時,KIV的產(chǎn)量從....

本文編號：4041415