發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 19:17

【摘要】：目的:通過(guò)高糖誘導(dǎo)損傷RSC96細(xì)胞,建立糖尿病周圍神經(jīng)病變的細(xì)胞模型,采用中藥葛根的有效成分葛根素進(jìn)行干預(yù),觀察葛根素治療前后凋亡、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,旨在探討葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞凋亡和自噬的影響及其作用機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)用RSC96細(xì)胞株購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù),建立體外RSC96細(xì)胞高糖損傷模型,采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)方法檢測(cè)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況判定造模成功后,確定造模用葡萄糖濃度為400 mmol.L~(-1)。采用CCK-8法確定葛根素干預(yù)濃度為0.5mmol.L~(-1),之后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、高糖組、葛根素干預(yù)組。其中空白對(duì)照組不添加任何藥物;高糖組:正常培養(yǎng)48h后,加400 mmol.L~(-1)高糖孵育1 h;葛根素干預(yù)組:正常培養(yǎng)48h后,用0.5mmol.L~(-1)的葛根素預(yù)處理RSC96細(xì)胞15min,隨后加400 mmol.L~(-1)的高糖孵育1 h。采用CCK-8法觀察細(xì)胞存活率;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Beclin-1蛋白的表達(dá);WB檢測(cè)Cleaved Caspase-3、LC3-II、p62、Beclin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與高糖組相比,葛根素預(yù)處理可顯著提高高糖誘導(dǎo)后的RSC96細(xì)胞存活率(P0.05),抑制Cleaved Caspase-3、LC3-II和Beclin-1蛋白的表達(dá)(P0.05),增強(qiáng)p62蛋白的表達(dá)(P0.05)。具體如下:1.400 mmol.L~(-1)高糖處理6h導(dǎo)致RSC96細(xì)胞損傷。用400 mmol.L~(-1)高糖處理0、3、6、9、12、24h;WB方法檢測(cè)各組Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示400 mmol.L~(-1)葡萄糖處理6h時(shí),RSC96細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著提高(P0.01)。2.葛根素預(yù)處理可提高高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞存活率,經(jīng)(0.1-1)mmol.L~(-1)濃度范圍的葛根素處理15min,葛根素干預(yù)濃度為0.5 mmol.L~(-1)時(shí),RSC96細(xì)胞存活率高于對(duì)照組(P0.05),隨著葛根素濃度的增加,細(xì)胞的存活率隨之下降。3.與對(duì)照組相比,葛根素干預(yù)組可降低Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),經(jīng)高糖處理后,Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P0.01);用0.5 mmol.L~(-1)葛根素預(yù)孵育15min后,Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)量明顯下降(P0.05)。4.與對(duì)照組相比,400 mmol.L~(-1)高糖處理1h可誘導(dǎo)RSC96細(xì)胞p62蛋白的表達(dá)明顯降低(P0.05);因此,后續(xù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白時(shí),我們選擇用400mmol.L~(-1)高糖處理1h。5.葛根素抑制高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞自噬的水平,葛根素干預(yù)組相較于高糖組,LC3-II蛋白表達(dá)下降(P0.05),p62蛋白表達(dá)升高(P0.05);Beclin-1蛋白的表達(dá)在免疫細(xì)胞化學(xué)法和WB法趨勢(shì)一致。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Beclin-1蛋白在高糖組中呈中陽(yáng)性,在葛根素干預(yù)組中呈弱陽(yáng)性;WB結(jié)果表明,葛根素干預(yù)組較高糖組可顯著抑制Beclin-1蛋白的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:葛根素預(yù)處理可顯著改善高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞凋亡。葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞自噬的保護(hù)作用可能與其抑制LC3-II和Beclin-1蛋白表達(dá)、提高p62蛋白表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 不同濃度 HG 處理 24h，對(duì) Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Fig. 1 Effects of 24 h treatment with different concentrations of HG on Cleaved Caspase-3protein (#P<0.05vs control)圖 2-1 400mmol.L-1HG 處理不同時(shí)間，RSC96 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（200×）

圖 1 不同濃度 HG 處理 24h，對(duì) Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Fig. 1 Effects of 24 h treatment with different concentrations of HG on Cleaved Caspase-3protein (#P<0.05vs control)
【學(xué)位授予單位】：湖北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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8 王s

本文編號(hào)：2593810