發(fā)布時(shí)間：2018-02-03 18:41

  本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 miR-454 PDK1 細(xì)胞增殖　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：膠質(zhì)瘤為目前世界范圍內(nèi)顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、手術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。膠質(zhì)瘤通常起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞或者神經(jīng)實(shí)質(zhì)細(xì)胞,按多種方法均可將膠質(zhì)瘤進(jìn)行分類,臨床上的膠質(zhì)瘤以星形細(xì)胞瘤最為常見。世界衛(wèi)生組織按照惡性化程度將臨床上膠質(zhì)瘤劃分為Ⅰ-Ⅳ級(jí),其中Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤屬于良性腫瘤,手術(shù)治療能夠?qū)⑵淝宄?同時(shí)其較少出現(xiàn)惡性進(jìn)展,患者預(yù)后效果較好；而Ⅱ、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤惡性化程度較高,其特點(diǎn)是具有一定的侵襲性；Ⅳ級(jí)的惡性化程度最高,相較于Ⅱ、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤更具有侵襲性,患者的預(yù)后情況也并不理想。通常將原發(fā)于腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的定義為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,而繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是由低級(jí)別的膠質(zhì)瘤,如Ⅱ、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤進(jìn)一步惡變所形成的。盡管現(xiàn)在已有運(yùn)用手術(shù)切除與放化療相結(jié)合的綜合治療手段對(duì)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行治療,然而患者的術(shù)后生存期仍然僅為1年左右。部分學(xué)者認(rèn)為,膠質(zhì)瘤之所以術(shù)后經(jīng)�！八阑覐�(fù)燃”,有一個(gè)重要原因就是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能夠“抗拒”放化療的殺傷。隨著組織病理學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者將焦點(diǎn)集中于對(duì)于膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究,同時(shí)還對(duì)膠質(zhì)瘤的臨床病理異質(zhì)性、基因的異常表達(dá)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路紊亂等一系列分子機(jī)制進(jìn)行了深入探索,上述研究有助于我們更全面透徹的了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制,這在臨床上對(duì)膠質(zhì)瘤患者的診斷和治療具有十分重要的意義。同時(shí),尋找新的治療膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的藥物或者分子靶向治療手段是學(xué)界研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。大量研究證實(shí),膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中,多種微小RNA (microRNAs, miRNAs)能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生或正或負(fù)的調(diào)節(jié)作用,miRNAs這種獨(dú)特的作用機(jī)制引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注。MiRNAs是長(zhǎng)度在20-25個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)范圍內(nèi)的一類內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA, miRNA降解靶mRNA或者抑制其翻譯的機(jī)制,是因?yàn)閙iRNAs與靶mRNA的3’非編碼區(qū)能完全或者不完全互補(bǔ),從而對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖以及凋亡等生理過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。因此,miRNAs就會(huì)和它的靶基因相作用形成一個(gè)重要的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生重要的影響,而且還對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)產(chǎn)生多種影響。最近的研究發(fā)現(xiàn),有超過(guò)50%的miRNAs定位于基因組的脆弱位點(diǎn)或者腫瘤相關(guān)基因區(qū)域,表明miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNAs可對(duì)惡性腫瘤的生成和進(jìn)展造成影響,這些影響主要表現(xiàn)為以下三個(gè)方面：首先,部分miRNAs在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有促癌基因的作用；其次,部分miRNAs可能抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,具有抑癌基因的功能；再次,某些致瘤病毒所編碼的miRNAs能夠參與相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,而病毒在其宿主體內(nèi)存活,亦可對(duì)機(jī)體細(xì)胞中的miRNA勺表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目的：研究miR-454通過(guò)抑制PDKl表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)作用機(jī)制,以期為臨床治療膠質(zhì)瘤提供新的有效靶點(diǎn)。方法：(1)熒光定量PCR檢測(cè)50例膠質(zhì)瘤患者瘤組織和人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)U87、T98G、A-172、LN18以及LN-229細(xì)胞系中miR-454和PDK1 mRNA表達(dá)；用western blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中PDK1蛋白的表達(dá)；分析膠質(zhì)瘤組織中PDK1蛋白的表達(dá)與臨床病理分級(jí)的關(guān)系。(2)向膠質(zhì)瘤T98G和LN18細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-454 mimic(使用化學(xué)方法合成,模擬生物體內(nèi)源的miRNA)和miR-454 inhibitor(使用化學(xué)方法合成的針對(duì)miRNA的抑制劑),MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響。(3)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-454的靶基因,檢測(cè)共轉(zhuǎn)染miR-454 mimic和PDK1-3'UTR/PDK1-3'UTR-mut(突變型)的T98G和I.N18細(xì)胞中熒光素酶的含量；western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-454 mimic 和 miR-454 inhibitor后細(xì)胞中PDK1、Cyclin D1、p21、p-pRb、pRb蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中miR-454 mRNA的表達(dá)顯著低于相應(yīng)正常腦組織和細(xì)胞系；膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中PDK1 mRNA及其編碼蛋白的含量顯著高于相應(yīng)正常腦組織及細(xì)胞系；LSD法分析表明,Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中PDK1蛋白的表達(dá)顯著高于I級(jí)和II級(jí)；Spearman分析表明膠質(zhì)瘤患者瘤組織中PDK1蛋白表達(dá)與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān),即在高級(jí)別病例組中高表達(dá),在低級(jí)別病例組中低表達(dá)。(2)成功構(gòu)建miR-454過(guò)表達(dá)和miR-454表達(dá)抑制細(xì)胞模型；上調(diào)細(xì)胞中miR-454的含量能夠抑制人膠質(zhì)瘤LN18和T98G細(xì)胞增殖,下調(diào)則能對(duì)上述兩種細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用；miR-454能夠?qū)⑷四z質(zhì)瘤LN18和T98G細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期,同時(shí)減少人膠質(zhì)瘤LN18和T98G細(xì)胞S期的數(shù)量。(3)PDK1為miR-454的靶基因；miR-454的含量增高后能夠顯著抑制人膠質(zhì)瘤T98G和LN18細(xì)胞中PDK1的表達(dá)；miR-454能顯著抑制T98G和LN18細(xì)胞中PDK1、Cyclin D1、p-pRb蛋白的表達(dá),上調(diào)p21蛋白的含量,但對(duì)pRb蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響。結(jié)論：(1)PDK1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)；(2)miR-454在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著抑癌基因的作用；(3)miR-454對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是通過(guò)抑制PDK1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1488079