發(fā)布時(shí)間：2018-08-26 14:23

【摘要】：卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,也是死亡率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤。根據(jù)WHO組織學(xué)分型,上皮性卵巢癌(epithelia ovarian cancer,EOC)是卵巢癌中最多見的組織學(xué)類型,EOC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為“初次理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)+以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療”,臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)盡管化療是其最重要的輔助治療手段,但很多患者在治療過(guò)程中出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)性化療耐藥,使化療效果不理想,復(fù)發(fā)率和死亡率居高不下,因此對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥過(guò)程中參與的生物分子的研究已成為卵巢癌研究熱點(diǎn)。通過(guò)對(duì)卵巢癌生物學(xué)和代謝機(jī)制的探索,期望找出卵巢癌分子靶向治療的有效靶點(diǎn)已成為目前卵巢癌研究的重要課題。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在細(xì)胞的調(diào)控方面具有重要作用,一方面miRNA通過(guò)控制癌細(xì)胞的啟動(dòng),調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡;另一方面作為與卵巢癌細(xì)胞耐藥密切相關(guān)的信號(hào)通路的上游或下游的效應(yīng)因子,miRNA可以促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡從而提高或降低卵巢癌細(xì)胞的化療敏感性。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在多種癌癥中異常表達(dá),如肝癌、前列腺癌或乳腺癌等,但是miR-199a在卵巢癌中作用的研究報(bào)道并不多見。在前期工作中我們通過(guò)芯片篩選并PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào),明顯低于鉑類敏感細(xì)胞中的表達(dá)水平,提示miR-199a-3p可能在維持或調(diào)節(jié)卵巢癌生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。miR-199a-3p在卵巢癌細(xì)胞中的差異表達(dá)具有何種意義?miR-199a-3p對(duì)卵巢癌生物學(xué)行為有何影響?miR-199a-3p在卵巢癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制是什么?為了回答上述問(wèn)題,本研究選擇miR-199a-3p作為卵巢癌發(fā)展和耐藥的研究靶點(diǎn)。通過(guò)臨床、細(xì)胞及活體不同水平的研究,初步探討miR-199a-3p在上皮性卵巢癌中的臨床意義及miR-199a-3p在EOC的發(fā)展及鉑類化療耐藥中的作用和可能調(diào)控機(jī)制。整合素是細(xì)胞表面粘附分子的一種,由α和β兩個(gè)次級(jí)別單位通過(guò)非共價(jià)鍵連接形成的細(xì)胞跨膜蛋白,胞外連接基質(zhì)蛋白或相鄰細(xì)胞,胞內(nèi)連接細(xì)胞骨架系統(tǒng),從而構(gòu)成腫瘤細(xì)胞賴以生存發(fā)展的空間紐帶;另一方面,整合素作為受體可與多種細(xì)胞因子結(jié)合,從而向細(xì)胞內(nèi)外雙向傳導(dǎo)生物信息,構(gòu)成腫瘤細(xì)胞感受外界刺激并做出相應(yīng)反應(yīng)的的信息樞紐。近年研究發(fā)現(xiàn)整合素表達(dá)于惡性腫瘤表面,并在腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和化療耐藥中表達(dá)上調(diào),整合素可能參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。利用生物信息分析軟件預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-199a-3p在卵巢癌中的靶基因?yàn)镮TGB8(Integrinβ8,整合素β8),通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明miR-199a-3p對(duì)ITGB8的靶向調(diào)控在EOC發(fā)展及鉑類耐藥中發(fā)揮的作用,初步探討miR-199a-3p/ITGB8信號(hào)通路參與EOC發(fā)展及鉑類耐藥的機(jī)制。目前,關(guān)于miR-199a-3p通過(guò)ITGB8參與EOC發(fā)展及鉑類耐藥的機(jī)制尚無(wú)報(bào)道,本研究將為miR-199a-3p在EOC發(fā)展及鉑類耐藥中的作用提供有力的直接證據(jù)。研究目的研究miR-199a-3p在EOC中的臨床意義及miR-199a-3p通過(guò)靶向調(diào)控ITGB8對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。初步探討miR-199a-3p在EOC的發(fā)展和鉑類耐藥中的作用和分子機(jī)制,為控制EOC的發(fā)展和化療耐藥提供候選靶點(diǎn)和理論支持。研究方法1.以正常卵巢組織、良性及交界性卵巢腫瘤及EOC鉑類耐藥和鉑類敏感病例的病理切片及臨床資料為研究對(duì)象,q RT-PCR法對(duì)不同組別miR-199a-3p表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)分析miR-199a-3p基因表達(dá)差異與EOC臨床病理因素、鉑類耐藥的相關(guān)性;2.選取卵巢癌親本株SKOV3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并通過(guò)濃度遞增的方法構(gòu)建SKOV3/DDP(SKOV3順鉑耐藥細(xì)胞)細(xì)胞株,通過(guò)MTT、Transwell和Wound healing方法檢測(cè)SKOV3/DDP及SKOV3在細(xì)胞耐藥指數(shù)、遷移和侵襲等方面的生物學(xué)效能,通過(guò)q RT-PCR方法檢測(cè)SKOV3和SKOV3/DDP中miR-199a-3p表達(dá)水平的差異;3.脂質(zhì)體法用miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞,通過(guò)MTT、Transwell和Wound healing方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞耐藥指數(shù)、遷移、侵襲能力和細(xì)胞凋亡的變化,初步分析miR-199a-3p對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;4.利用生物信息分析軟件預(yù)測(cè)并查閱文獻(xiàn)總結(jié)miR-199a-3p可能靶基因,q RT-PCR和WB方法檢測(cè)SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞中可能靶基因m RNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平;綜合分析ITGB8是miR-199a-3p的可能靶基因;5.通過(guò)脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic和miR-199a-3p inhibitor后檢測(cè)SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞中ITGB8表達(dá)的變化進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199a-3p對(duì)ITGB8的靶向調(diào)控作用;6.通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證證實(shí)ITGB8是miR-199a-3p的靶基因,并確定了miR-199a-3p與ITGB8的結(jié)合位點(diǎn);7.利用重組質(zhì)粒技術(shù)構(gòu)建ITGB8過(guò)表達(dá)載體:在NCBI網(wǎng)站查找ITGB8基因序列,找出ITGB8的ORF,根據(jù)pc DNA3.1的載體圖譜選擇合適的酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR的方式克隆目的基因,被消化后插入pc DNA3.1,構(gòu)建pc DNA3.1-ITGB8重組質(zhì)粒;8.通過(guò)脂質(zhì)體法用miR-199a-3pmimic、inhibitor和(或)pc DNA3.1-ITGB8分別轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞,分析miR-199a-3p通過(guò)靶向調(diào)控ITGB8對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;9.MTT法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組對(duì)順鉑的化療敏感性;Transwell檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力,分析miR-199a-3p通過(guò)靶向調(diào)控ITGB8對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。10.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各個(gè)轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期和凋亡的變化,分析miR-199a-3p通過(guò)靶向調(diào)控ITGB8對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用。11.構(gòu)建卵巢癌原位異種模型:分別注射SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞懸液于裸鼠卵巢包膜下,成瘤后比較卵巢原位移植瘤大小、重量及腹腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目等。12.通過(guò)q RT-PCR方法檢測(cè)分別注射SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞后成瘤的卵巢原位移植瘤組織標(biāo)本中miR-199a-3p表達(dá)水平。13.通過(guò)q RT-PCR和Westen-Blot方法檢測(cè)注射SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞后成瘤的卵巢原位移植瘤組織標(biāo)本中ITGB8的m RNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量。研究結(jié)果1.miR-199a-3p在EOC中的臨床意義及其與鉑類耐藥的關(guān)系(1)與正常卵巢組織相比,miR-199a-3p的表達(dá)在卵巢良性上皮性腫瘤中無(wú)明顯差異,卵巢交界性腫瘤中輕微下降,而EOC中明顯下降;(2)相對(duì)于EOC鉑類敏感組織,耐藥組織中miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)水平明顯下降,提示miR-199a-3p與EOC的耐藥有相關(guān)性;(3)根據(jù)手術(shù)病理分期,隨著卵巢癌期別增加,miR-199a-3p的表達(dá)逐漸減少;不同組織學(xué)分級(jí)中,分化程度越差,miR-199a-3p的表達(dá)水平越低;在有無(wú)合并淋巴轉(zhuǎn)移中,伴淋巴轉(zhuǎn)移者較無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者miR-199a-3p的表達(dá)明顯減低;不同組織學(xué)類型miR-199a-3p的表達(dá)未見明顯差異。說(shuō)明miR-199a-3p的表達(dá)水平與EOC分期、分化程度及淋巴有無(wú)轉(zhuǎn)移等臨床特征具有相關(guān)性,隨著EOC分期和惡性程度的升高,miR-199a-3p表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì),miR-199a-3p與EOC的發(fā)展相關(guān)。2.miR-199a-3p在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(1)培養(yǎng)并構(gòu)建卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP,在細(xì)胞化療耐藥、遷移和侵襲等生物學(xué)效能方面,SKOV3/DDP細(xì)胞均明顯強(qiáng)于SKOV3細(xì)胞;(2)SKOV3/DDP細(xì)胞中miR-199a-表達(dá)水平明顯低于SKOV3細(xì)胞;(3)上調(diào)miR-199a-3p的表達(dá),SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性下降,敏感性增加,顯著促進(jìn)順鉑介導(dǎo)的凋亡,抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力;下調(diào)miR-199a-3p的表達(dá),SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性下降,耐藥性增加,顯著抑制順鉑介導(dǎo)的凋亡,增強(qiáng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力;提示miR-199a-3p在EOC中具有抑癌基因的作用,抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡,并增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性;3.miR-199a-3p靶向調(diào)控ITGB8(1)生物信息分析及文獻(xiàn)總結(jié)miR-199a-3p的可能靶基因,q RT-PCR和WB方法檢測(cè)SKOV3/DDP及SKOV3中這些可能靶基因m RNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平,在這些可能靶基因中ITGB8表達(dá)及變化顯著;(2)利用生物信息功能分析miR-199a-3p靶基因中ITGB8與miR-199a-3p關(guān)聯(lián)性強(qiáng),而整合素與卵巢癌的發(fā)展和化療耐藥相關(guān);(3)miR-199a-3p表達(dá)下調(diào)時(shí),ITGB8蛋白表達(dá)水平升高;miR-199a-3p表達(dá)上調(diào)則顯著抑制ITGB8蛋白表達(dá)水平,miR-199a-3p對(duì)ITGB8呈負(fù)向調(diào)控作用。(4)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-199a-3p直接靶向調(diào)控ITGB8,ITGB8-3’UTR-2是miR199a-3p和ITGB8的靶結(jié)合位點(diǎn);4.miR-199a-3p通過(guò)直接靶向調(diào)控ITGB8影響卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為(1)構(gòu)建pc DNA3.1-ITGB8重組質(zhì)粒,過(guò)表達(dá)ITGB8;(2)下調(diào)miR-199a-3p或上調(diào)ITGB8時(shí),卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低,耐藥性增加,同時(shí)下調(diào)miR-199a-3p并上調(diào)ITGB8時(shí)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性進(jìn)一步降低,耐藥性進(jìn)一步增加,說(shuō)明下調(diào)miR-199a-3p可以增強(qiáng)ITGB8的作用;另一方面,當(dāng)miR-199a-3p表達(dá)上調(diào),細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增加,耐藥性減低,同時(shí)上調(diào)miR-199a-3p和ITGB8時(shí),ITGB8的作用被抑制,說(shuō)明下調(diào)miR-199a-3p可以抑制ITGB8的作用。(3)ITGB8表達(dá)上調(diào)時(shí),SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲能力增加,下調(diào)miR-199a-3p可以增強(qiáng)ITGB8的這一作用;上調(diào)miR-199a-3p則降低ITGB8的這一作用。(4)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率顯示:上調(diào)ITGB8的表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞增殖和順鉑介導(dǎo)的凋亡,下調(diào)miR-199a-3p可以增強(qiáng)ITGB8的這一作用;上調(diào)miR-199a-3p則降低ITGB8的這一作用。(5)構(gòu)建卵巢癌原位異種模型,與注射SKOV3組小鼠模型相比,SKOV3/DDP組裸鼠模型形成較多的腹腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),卵巢原位腫瘤的體積更大,重量更重;腫瘤組織內(nèi)miR-199a-3p的表達(dá)水平明顯降低,ITGB8 m RNA表達(dá)水平和蛋白含量明顯升高。結(jié)論1.miR-199a-3p的表達(dá)隨EOC惡性程度及分期的升高而下降,并在鉑類耐藥組織中表達(dá)水平下降,說(shuō)明miR-199a-3p與EOC的發(fā)展和鉑類耐藥相關(guān);2.miR-199a-3p通過(guò)直接靶向作用負(fù)向調(diào)控ITGB8,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性;3.miR-199a-3p通過(guò)直接靶向作用負(fù)向調(diào)控ITGB8抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移;4.在動(dòng)物模型內(nèi),與卵巢癌親本細(xì)胞相比,卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞原位成瘤能力及轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng),其原位腫瘤組織內(nèi)miR-199a-3p的表達(dá)水平下降,ITGB8的表達(dá)增加;5.miR-199a-3p/ITGB8信號(hào)通路在EOC發(fā)展和鉑類化療耐藥中發(fā)揮了抑癌基因的作用。當(dāng)miR-199a-3p表達(dá)下調(diào),通過(guò)上調(diào)靶基因ITGB8的表達(dá),增加卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展;同時(shí)使癌細(xì)胞的凋亡減少,通過(guò)卵巢癌鉑類耐藥中的靶后機(jī)制導(dǎo)致化療耐藥,miR-199a-3p有望成為卵巢癌靶向治療的新的生物分子。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.31
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本文編號(hào)：2205140