發(fā)布時間：2020-05-05 17:57

【摘要】：一、研究背景:胃癌是我國最常見的消化道腫瘤之一。2008年胃癌發(fā)病率居全球第4位,死亡率居第2位。其中,復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因[1,2]。所以,探討胃癌復(fù)發(fā)和遷移侵襲能力增加的分子生物學(xué)機制,對胃癌的診斷治療和預(yù)防至關(guān)重要。miR-28與人類的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-19]。而miR-28-3P與腫瘤的相關(guān)性,文獻報道很少,生物信息學(xué)分析顯示,PTEN可能是miR-28-3P的靶基因,它可以阻止PI3K的活化,進而抑制AKT的磷酸化來達到阻斷腫瘤細胞失控性增殖的目的[20]。目前,miR-28-3P與胃癌的關(guān)系并不清楚,miR-28-3P與PTEN及PI3K/AKT通路之間的關(guān)系,也不清楚,如果本研究明確miR-28-3P在胃癌中的作用及機制,將為胃癌的靶向治療提供重要的理論基礎(chǔ)和新的治療靶點。二、研究目的通過探討miR-28-3P與胃癌的臨床病理特點之間的關(guān)系以及它在胃癌的增殖、遷移侵襲中的主要作用及機制,為胃癌的早期診斷和治療提供重要的理論基礎(chǔ)。三、研究方法1.采用Q-RT-PCR和western blot的實驗方法檢測胃癌患者miR-28-3P的表達情況;2.shmiR-28-3P慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細胞系,進行CCK8細胞增殖實驗,平板克隆實驗以及細胞遷移侵襲實驗、劃痕實驗等,體外檢測miR-28-3P對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。3.裸鼠皮下成瘤實驗體內(nèi)檢測miR-28-3P對胃癌細胞增殖、凋亡以及皮下成瘤能力的影響,并進行免疫組化實驗和HE來驗證細胞惡性行為的變化及移植瘤血管生成情況。4.熒光素酶報告和生物信息學(xué)分析及功能回復(fù)實驗來探討miR-28-3P在胃癌細胞中的具體的作用靶點及其作用機制。四、實驗結(jié)果1.miR-28-3P在胃癌組織及細胞系中呈高表達狀況;2.shmiR-28-3P慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細胞后,細胞的增值能力下降,抑凋亡蛋白Bcl2的表達量下降,凋亡蛋白Caspase3的表達量增加;胃癌細胞的遷移侵襲能力和劃痕愈合能力明顯下降,與遷移侵襲相關(guān)的蛋白MMP的表達也明顯下降;3.裸鼠成瘤實驗表明抑制了 miR-28-3P以后,胃癌細胞的裸鼠成瘤能力下降,移植瘤體積縮小;組織的異型性下降,和腫瘤微血管形成明顯相關(guān)的基因CD31在免疫組化中呈現(xiàn)出低表達;4.抑制miR-28-3P的表達后,熒光素酶報告實驗及功能回復(fù)實驗顯示PTEN基因是miR-28-3P下游作用的靶基因;抑制miR-28-3P的表達后,胃癌細胞株中PI3K/AKT呈現(xiàn)低表達的現(xiàn)象,證明了 miR-28-3P可能是通過抑制PTEN來激活PI3K/AKT通路,促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的。五、結(jié)論miR-28-3P在胃癌組織和多種胃癌細胞株中呈現(xiàn)高水平表達。miR-28-3P的高表達會促進細胞的增殖、遷移侵襲及惡性轉(zhuǎn)化。抑制胃癌細胞株中miR-28-3P的表達,可以促進其靶基因PTEN的表達,抑制PI3K/AKT通路的激活,從而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。而這一作用可能是通過調(diào)節(jié)miR-28-3P—PTEN—PI3K/AKT通路來實現(xiàn)的。
【圖文】：

轉(zhuǎn)染細胞在培養(yǎng)箱中溫育６小時。吸棄轉(zhuǎn)染液，用Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ邋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ漂洗逡逑后，轉(zhuǎn)染ＮＣ－ＦＡＭ的細胞加入１５０４培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果。逡逑由圖２．２可見：隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加轉(zhuǎn)染效率也是逐漸增加的。但是１０ｐｍｏｌ的慢逡逑病毒和２０ｐｍｏｌ的慢病毒之間的轉(zhuǎn)染效率差異不是很顯著，所以我們選定１０ｐｍｏｌ逡逑的濃度作為轉(zhuǎn)染濃度。在熒光顯微鏡下，，我們觀察到感染陽性的細胞達（５６±３．２）逡逑％。逡逑３８逡逑

２．３轉(zhuǎn)染效率的ＰＣＲ－ＲＮＡ驗證逡逑運用ＰＣＲ技術(shù)驗證ｓｈｍｉＲ－２８－３Ｐ干擾序列慢病毒下調(diào)ｍｉＲ－２８－３Ｐ的表達情逡逑況（如圖２．３），結(jié)果顯示，ｍｉＲ－２８－３Ｐ在經(jīng)過慢病毒的轉(zhuǎn)染以后，確實出現(xiàn)了明逡逑顯的下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑３９逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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本文編號：2650540