發(fā)布時間：2020-05-08 09:40

【摘要】：目的構建表達C端截短HBX基因和蛋白的人肝癌HepG2細胞模型,并探討其對HepG2細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響。方法1.以肝癌組織中HBX常見的整合片段HBXΔ32(C端缺失32個氨基酸的HBX,全長369bp)、HBXΔ4(C端缺失4個氨基酸的HBX,全長453bp)和野生型HBX(全長465bp)為目的片段,分別構建腺病毒載體并轉染HepG2細胞。以轉染后的LV5-HBXΔ32、LV5-HBXΔ4、LV5-HBX細胞為實驗組,LV5-NC(空病毒)和HepG2細胞為對照組探討C端截短HBX對HepG2細胞生物學活性的影響。2.采用qPCR和WB的方法分別檢測轉染后的各組細胞HBX基因和蛋白的表達情況,判斷轉染是否成功。3.在培養(yǎng)基中加入CCK8,分別于1小時、2小時、3小時、4小時后檢測并比較各組細胞OD值,探討C端截短HBX對HepG2細胞增殖的影響。4.采用transwell實驗檢測轉染后各組細胞的侵襲和遷移能力,探討C端截短HBX對HepG2細胞侵襲和遷移的影響。5.采用流式細胞學技術檢測轉染后各組細胞凋亡的情況,探討C端截短HBX對HepG2細胞凋亡的影響。結果1.本研究成功構建了表達C端截短HBX基因和蛋白的HepG2細胞,鏡下可觀察到GFP綠色熒光信號,經qPCR和WB驗證有HBX mRNA和蛋白的表達。2.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組細胞之間的增殖能力有差異,每個檢測時間點其OD值差別有統(tǒng)計學意義(P值均0.05)。經兩兩比較發(fā)現,每個檢測時間點HBXΔ32和HBXΔ4組細胞OD值均高于其他各組,且差異有統(tǒng)計學意義(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4組之間細胞的OD值差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組發(fā)生侵襲的細胞數分別為277.89±20.64、266.78±22.09、163.44±21.02、157.78±22.02和160.56±21.51,各組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。經兩兩比較發(fā)現,HBXΔ32和HBXΔ4組侵襲細胞數均高于其他各組,且差異有統(tǒng)計學意義(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4組之間侵襲細胞數差異無統(tǒng)計學意義(P=0.856)。4.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組發(fā)生遷移的細胞數分別為95.22±16.84、94.44±12.99、66.56±9.50、71.00±8.79和69.78±9.71,各組之間遷移細胞數差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。經兩兩比較發(fā)現,HBXΔ32和HBXΔ4組遷移細胞數均高于其他各組,且差異有統(tǒng)計學意義(P值均0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4組之間遷移細胞數差異無統(tǒng)計學意義(P=0.588)。5.HBXΔ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各組之間細胞凋亡率分別為1.43±0.522%、1.14±0.236%、1.06±0.033%、1.26±0.466%、1.24±0.653%,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.505)。結論C端截短的HBXΔ32、HBXΔ4對人肝癌HepG2細胞的增殖、侵襲、遷移能力有一定的促進作用,并未發(fā)現其對HepG2細胞的凋亡有影響。HBX C端的后4-32個氨基酸可能不是影響肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的主要功能域。本研究初步解釋了C端截短的HBX基因的整合在廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝癌發(fā)病中所起的作用,為HBV相關性HCC的病因學探討和綜合防治提供了一定的實驗依據和理論參考。
【圖文】：

C 端截短 HBX 對 HepG2 細胞生物學活性的影響 碩士學位結 果1. 腺病毒結構和測序結果1.1 腺病毒結構該腺病毒由上海生工生物工程股份有限公司構建，，結構如圖 3-1所示腺病毒的穿梭質粒為 LV5，該質粒包含表達綠色熒光蛋白的 GFP 基因以及呤霉素和氨芐青霉素抗性基因（后續(xù)篩選實驗需要），啟動子為 CMV 和 Eα ,酶切位點為 NotI/NsiI。

C 端截短 HBX 對 HepG2 細胞生物學活性的影響 碩士學位論文1.2 測序結果該腺病毒構建完成后由上海生工生物工程股份有限公司測序驗證，測序結果如圖 3-2、3-3、3-4 所示。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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