【摘要】：肺癌是當今世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,嚴重危害人類健康。肺癌可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。非小細胞肺癌主要包括鱗癌、腺癌和大細胞癌,約占肺癌總數(shù)的85%。肺癌患者在早期一般少有明顯癥狀,確診時多數(shù)已經(jīng)處于中、晚期,其5年存活率不足15%。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高肺癌患者生存率的有效方法。因此,尋找特異性和靈敏度高的腫瘤生物學(xué)標志物,研究其在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其分子機制具有至關(guān)重要的意義。microRNA(miRNA,miR)是具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,長度大約為18-24個核苷酸,主要通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制或者mRNA降解,從而調(diào)控靶基因的表達。研究表明,microRNA的異常表達在腫瘤的形成、生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用,它既可作為癌基因,促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,也可作為抑癌基因,保護機體免于癌癥的發(fā)生。有關(guān)microRNA與腫瘤關(guān)系的深入研究已受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的極大關(guān)注。因此,開展miRNAs與肺癌關(guān)系的研究,有望為肺癌的早期診治提供新的方案和新的靶點。miR-10a-5p是近年來發(fā)現(xiàn)的一個miRNA分子,有研究顯示miR-10a-5p作為癌基因在多種腫瘤(包括肺癌)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,且生物信息學(xué)提示GATA6和miR-10a-5p在多種生物物種中存在保守性綁定結(jié)合位點。GATA6(GATA binding protein 6)是進化保守的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,它在胚胎發(fā)育過程中主要參與細胞增殖與分化的調(diào)控。GATA家族共有六個分子:GATA1/2/3主要表達于造血系統(tǒng)細胞,GATA4/5/6則主要表達于中胚層和內(nèi)胚層來源的組織,如肺、心臟、消化道、肝臟等。近期研究報道GATA6對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要調(diào)控作用,并且在不同組織來源的腫瘤中表達變化和生物學(xué)作用亦不相同。非小細胞肺癌中miR-10a-5p是否能通過靶定GATA6基因影響肺癌的發(fā)生發(fā)展,值得進一步研究。紫草素(shikonin)是從紫草科植物紫草部提取出的一種活性成分,它的化學(xué)結(jié)構(gòu)為萘醌類化合物,具有解毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。紫草素可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。由于紫草素的毒性較強而其抗腫瘤作用不具特異性,未能在臨床上被推廣應(yīng)用。β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikon,β-HIVS)是天然存在的紫草素生物之一。研究發(fā)現(xiàn),β-HIVS可通過抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和干擾腫瘤細胞周期等方式發(fā)揮其抑癌功效,具有成為新型高效低毒抗腫瘤藥物的潛力。本課題通過體內(nèi)外實驗,研究miR-10a-5p與非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以及β-HIVS抗肺癌的分子作用機制,為尋找高靈敏性和特異性的肺癌診斷標志物及臨床肺癌分子靶向治療提供新的靶點和理論依據(jù)。第一章 miR-10a-5p在非小細胞肺癌患者組織和血清中的表達及臨床意義目的:檢測非小細胞肺癌患者組織和血清中miR-l0a-5p表達,探討其與臨床病理特征的關(guān)系。方法:(1)收集NSCLC患者血清標本80份,健康志愿者血清75份。肺癌患者手術(shù)切除新鮮癌組織和癌旁組織20對。(2)通過qRT-PCR法檢測組織和血清中miR-l0a-5p的表達水平。(3)分析NSCLC患者組織和血清中miR-10a-5p表達水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。(4)以受試者工作特征曲線評價miRNA-10a-5p用于診斷非小細胞肺癌的價值。結(jié)果:(1)NSCLC患者癌組織中miRNA-10a-5p表達水平明顯高于癌旁組織,NSCLC患者組血清miR-10a-5p表達高于健康對照組。(2)miR-10a-5p表達水平與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。(3)血清miR-10a-5p診斷NSCLC的曲線下面積(AUC)為0.709,其靈敏度和特異度分別為65.98%和72.71%。與癌胚抗原(CEA)的聯(lián)合診斷可提高診斷價值,AUC為0.801,敏感性為76.34%;特異性為79.26%。結(jié)論:miR-l0a-5p與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),有望成為非小細胞肺癌早期診斷的生物標志物。第二章 miR-10a-5p對非小細胞肺癌細胞生物學(xué)行為的影響目的:探討miR-10a-5p對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響。方法:(1)以正常肺上皮細胞BEAS-2B為對照,通過qRT-PCR技術(shù)檢測肺癌細胞株A549、H1650和H1299中miR-10a-5p的表達水平;選取miR-10a-5p高水平表達的細胞株作為后續(xù)實驗的研究對象。(2)慢病毒感染A549細胞,下調(diào)細胞株中miR-l0a-5p的表達水平。(3)采用CCK8法、流式細胞術(shù)、Transwell小室法檢測miR-10a-5p對肺癌A549細胞的增殖、侵襲、遷移以及細胞周期的影響。(4)建立A549細胞裸鼠移植瘤模型,檢測miR-10a-5p對腫瘤生長的影響,檢測腫瘤體積、質(zhì)量等,繪制腫瘤生長曲線,并計算抑瘤率。結(jié)果:(1)肺癌細胞株A549中miR-10a-5p具有較高的表達水平。(2)慢病毒感染后,A549細胞中miR-10a-5p的表達水平明顯降低(P0.05)。(3)體外實驗顯示,下調(diào)miR-10a-5p的表達能夠抑制A549細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、阻滯細胞G1期向S期的發(fā)展、抑制細胞侵襲和遷移。(4)體內(nèi)實驗顯示,下調(diào)miR-10a-5p的表達能夠顯著抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長。結(jié)論:體內(nèi)外實驗結(jié)果表明,miR-10a-5p作為癌基因,下調(diào)其表達水平可顯著抑制A549肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。第三章miR-10a-5p在非小細胞肺癌中的靶基因及其作用機制目的:研究miR-1 Oa-5p在NSCLC中的靶基因、分子通路及其作用機制。方法:(1)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-10a-5p的靶基因。(2)采用雙熒光素酶報告基因法驗證miR-10a-5p對所預(yù)測靶基因是否具有直接靶向調(diào)控作用。(3)采用免疫組化法檢測NSCLC患者癌組織、癌旁組織以及裸鼠移植瘤中靶基因的表達情況。(4)Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測miR-10a-5p對靶基因及其下游基因的蛋白和mRNA的表達影響。結(jié)果:(1)生物學(xué)信息提示,miR-10a-5p在多種生物中與GATA6的3'UTR區(qū)存在保守性結(jié)合位點。(2)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?miR-10a-5p可直接靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子GATA6基因。(3)免疫組化實驗結(jié)果顯示,肺癌組織中GATA6表達低于癌旁組織,下調(diào)miR-10a-5p組裸鼠移植瘤中的GATA6表達明顯高于空白對照組和陰性對照組。(4)下調(diào)A549細胞miR-10a-5p表達后,細胞中GATA6蛋白和mRNA的表達水平升高,EGFR、CTNNB1蛋白和mRNA的表達水平降低。結(jié)論:miR-10a-5p對非小細胞肺癌作用機制可能與靶向調(diào)控GATA6基因,進而激活EGFR和Wnt信號通路相關(guān)第四章 β-羥基異戊酰紫草素對A549肺癌細胞的生長抑制作用及其分子機制目的:研究β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對人肺癌A549細胞生物學(xué)功能的影響,并對其機制進行初步探討。方法:(1)體外實驗:①以不同濃度的β-HIVS處理A549肺癌細胞。②采用CCK-8法、流式細胞術(shù)、Transwell小室法檢測β-HIVS對細胞增殖、周期、凋亡及侵襲和遷移的影響。③qRT-PCR技術(shù)和Western blot法檢測β-HIVS對A549細胞中miR-10a-5p表達影響,及GATA6、EGFR、CTNNB1、P53、Bcl-2的mRNA和蛋白表達的影響。(2)體內(nèi)實驗:①建立人肺癌裸鼠移植瘤模型,隨機分為對照組,β-HIVS低、中、高劑量(10、20、40mg/kg)組和紫杉醇(30mg/kg)組;②各組予以腹腔注射給藥,每次0.2mL,每周2次,連續(xù)用藥4周;③檢測裸鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量等,繪制腫瘤生長曲線,并計算抑瘤率。TUNEL法檢測β-HIVS處理后各組移植瘤組織中細胞凋亡情況;④免疫組化法、Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測β-HIVS對移植瘤組織中miR-10a-5p、GATA6、EGFR、CTNNB1、P53、Bcl-2蛋白和mRNA的表達的影響。結(jié)果:(1)體外實驗①β-HIVS能夠抑制A549肺癌細胞的增殖、侵襲、遷移,阻滯細胞G1期向S期發(fā)展。②β-HIVS上調(diào)p53蛋白和mRNA表達,下調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達,且具有呈濃度依賴性。③β-HIVS作用A549細胞前后,miR-l0a-5p和GATA6表達沒有明顯改變(P0.05)。(2)體內(nèi)實驗①β-HIVS能夠呈劑量依賴性抑制肺癌裸鼠移植瘤生長,能明顯縮小腫瘤體積。②TUNEL法顯示,與對照組相比β-HIVS處理后腫瘤細胞凋亡明顯增多。③免疫組化、Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示,β-HIVS處理后移植瘤組織中p53蛋白及mRNA表達升高,而Bcl-2蛋白及mRNA表達降低。結(jié)論:β-羥基異戊酰紫草素能抑制非小細胞肺癌生長,作用機制可能與通過調(diào)節(jié)p53和Bcl-2表達,進而誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)。研究結(jié)果對開發(fā)適宜中藥制劑或有效成份實施肺癌分子靶向治療提供了重要的實驗依據(jù)
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
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本文編號：
2655019
