發(fā)布時間：2020-11-18 19:02

　　 背景和目的:肺癌是常見的惡性腫瘤之一,非小細(xì)胞肺癌占85%。目前治療包括手術(shù)切除、鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療、放療及靶向治療,但肺癌發(fā)生機制不完全清楚。因此,探索新的關(guān)鍵分子,對明確肺癌發(fā)生機制及靶向治療有重要意義。甘氨酸脫羧酶(glycine decarboxylase,GLDC)是連接甘氨酸代謝與腫瘤發(fā)生的代謝致癌基因,在腫瘤干細(xì)胞豐富的原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中過度表達(dá),可以驅(qū)動NSCLC腫瘤干細(xì)胞,另外腫瘤干細(xì)胞的生長和致瘤能力都依賴于高水平GLDC的表達(dá),因此GLDC可以作為干細(xì)胞表面標(biāo)志物來識別腫瘤干細(xì)胞。目前GLDC已出現(xiàn)在多種腫瘤中,非小細(xì)胞肺癌尤為突出,與患者預(yù)后呈正相關(guān)�；�因選擇性剪接(alternative splicing,AS)是人類基因調(diào)控最常見的機制之一,在腫瘤的生理過程和細(xì)胞發(fā)育過程中至關(guān)重要,但GLDC在NSCLC中的選擇剪切調(diào)控機制迄今未見報道,因而了解GLDC剪接體生物學(xué)作用及功能可以為今后腫瘤的早期診斷和治療奠定理論基礎(chǔ)。本實驗旨在克隆人GLDC基因可變剪接體,分析生物學(xué)活性,為非小細(xì)胞肺癌發(fā)生機制及靶向治療提供指導(dǎo)意義。方法:1.構(gòu)建克隆載體:在NCBI中查找人的GLDC全長(glycine decarboxylase full length,GLDCfl)及其剪接體GLDC varient1(GLDCV1)序列,根據(jù)其cDNA設(shè)計引物,通過RT-PCR結(jié)合測序的方法檢測人肺腺癌細(xì)胞A549及正常細(xì)胞MRC5中GLDCfl及GLDCV1 mRNA的表達(dá)并對其進行擴增;同時在MRC5細(xì)胞中過表達(dá)GLDCfl及GLDCV1,蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá);2.體外功能實驗:用MTT法檢測過表達(dá)對MRC5細(xì)胞活力的影響,BrdU、平板克隆、瓊脂克隆形成實驗檢測對細(xì)胞增殖能力影響,RT-PCR檢測過表達(dá)對干性基因標(biāo)志物CD44、ALDH1的影響,同時驗證是否影響乳酸生成;3.體內(nèi)功能實驗:用GLDCfl及GLDCV1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MRC5細(xì)胞,篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后注入裸鼠皮下,以空載質(zhì)粒為陰性對照,觀察成瘤能力;4.用篩選好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞驗證過表達(dá)對腫瘤相關(guān)信號通路PI3K/AKT、JAK/STAT、ERK/MAPK通路蛋白表達(dá)的影響,同時驗證對細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.A549和MRC5中GLDCfl及剪接體GLDCV1在RNA水平均存在,蛋白印跡法顯示蛋白水平僅A549表達(dá);2.在體外將GLDCfl及剪接體GLDCV1過表達(dá)于MRC5細(xì)胞,48h后用MTT法檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力增加;BrdU、瓊脂克隆及平板克隆實驗證明過表達(dá)會促進MRC5細(xì)胞的增殖;RT-PCR檢測干細(xì)胞標(biāo)志物顯示過表達(dá)促進CD44和ALDH1表達(dá);轉(zhuǎn)染24h后檢測乳酸生成增多;3.體內(nèi)荷瘤實驗證明穩(wěn)轉(zhuǎn)GLDCV1剪接體在裸鼠體內(nèi)具有致瘤性;4.對過表達(dá)促進細(xì)胞增殖的機制進行研究,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)會使ERK/MAPK信號通路上P-ERK、P-P38蛋白表達(dá)增多,說明過表達(dá)可能通過ERK/MAPK信號通路發(fā)揮促進細(xì)胞增殖的作用。同時過表達(dá)還可以使CyclinD1表達(dá)增多。結(jié)論:1.本研究分析了GLDC基因選擇性剪接體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)形式,并揭示了GLDC及其變體在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)作用。2.通過在MRC5中過表達(dá)GLDCfl及其剪接體GLDCV1證明過表達(dá)對MRC5的細(xì)胞活力、增殖能力、克隆形成能力、干細(xì)胞標(biāo)志物、乳酸生成及成瘤能力均有促進作用。3.發(fā)現(xiàn)過表達(dá)可能通過ERK/MAPK信號通路發(fā)揮促進細(xì)胞增殖的作用。4.過表達(dá)GLDCfl及其剪接體GLDCV1會通過影響CyclinD1的表達(dá)促進細(xì)胞增殖。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

第 4 章 實驗結(jié)果.1 GLDC 基因選擇性剪接變體在非小細(xì)胞肺癌中的存在形式實驗前期首次發(fā)現(xiàn)了 GLDCV1 的存在，為了初步判斷 GLDC 基因選擇性變體在非小細(xì)胞肺癌中的存在形式，利用 RT-PCR 的方法，在人正常肺細(xì)RC5 和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 A549 中進行基因擴增，根據(jù)前期實驗顯示，在子 1 和 6 的位置設(shè)計引物即擴增 406-1039 片段更容易鑒別和擴增出全LDCfl。遂針對片段 1-1039 和 406-1039 擴增 GLDCV1 和 GLDCfl 的引物。結(jié)果如下圖 4.1 所示，在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中均可以擴增出與預(yù)期片段大小的片段。對片段進行膠回收測序，顯示 GLDCfl 與原報道中的相同，GLDC缺失 49-448 之間 400bp 長度的片段。

2 GLDC 蛋白在非小細(xì)胞肺癌 A549 及正常肺 MR蛋白表達(dá)情況DC 及其變體的生物學(xué)作用研究過表達(dá)載體載體的構(gòu)建由金唯智公司完成，所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn) blot 的方法檢測質(zhì)粒表達(dá)情況，結(jié)果如下圖 4.3 所V1 在 MRC5 細(xì)胞中的表達(dá)增高。

GLDC 蛋白在非小細(xì)胞肺癌 A549 及正常肺 MRC蛋白表達(dá)情況C 及其變體的生物學(xué)作用研究過表達(dá)載體載體的構(gòu)建由金唯智公司完成，所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染 lot 的方法檢測質(zhì)粒表達(dá)情況，結(jié)果如下圖 4.3 所示V1 在 MRC5 細(xì)胞中的表達(dá)增高。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉東,李奕,張道榮;p~(21)~(WAF1)及CyclinE在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J];實用腫瘤學(xué)雜志;2002年04期

本文編號：2889082