發(fā)布時間：2025-06-26 04:59

　　 目的構(gòu)建人GINS2基因酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒,并進(jìn)行自激活檢測。方法根據(jù)GenBank中登錄的GINS2基因編碼區(qū)序列（NM₀16095）設(shè)計(jì)引物,以pCDNA3. 1-GINS2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物克隆至誘餌載體pGBKT7上,構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GINS2。將鑒定正確的誘餌質(zhì)粒及對照質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞AH109中培養(yǎng),Western blot法檢測誘餌蛋白GINS2的表達(dá),隨機(jī)挑取6個菌落,進(jìn)行His3、Ade2及LacZ報(bào)告基因的自激活效應(yīng)檢測。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測序鑒定證明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GINS2構(gòu)建正確。誘餌蛋白GINS2相對分子質(zhì)量為21 000,可在AH109酵母細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在SD/-Trp/-Leu缺陷平板生長,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上不生長,表明報(bào)告基因His、Ade2未被激活,報(bào)告基因LacZ檢測結(jié)果與陰性對照相同,表明誘餌蛋白GINS2不存在自激活。結(jié)論成功構(gòu)建了人GINS2基因酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒,其表達(dá)蛋白對酵母AH109細(xì)胞無毒性,也無自激活現(xiàn)象,可用...

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圖1 GINS2基因PCR產(chǎn)物電泳圖

經(jīng)Westernblot分析，誘餌蛋白GINS2的相對分子質(zhì)量約為21000，大小與預(yù)期結(jié)果一致，見圖3。表明該誘餌蛋白在AH109酵母細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。圖2重組質(zhì)粒pGBKT7-GINS2的雙酶切鑒定（EcoRⅠ/BamHⅠ）

圖2 重組質(zhì)粒pGBKT7-GINS2的雙酶切鑒定（EcoRⅠ/BamHⅠ）

圖1GINS2基因PCR產(chǎn)物電泳圖圖3誘餌蛋白GINS2的Westernblot分析

圖3 誘餌蛋白GINS2的Western blot分析

圖2重組質(zhì)粒pGBKT7-GINS2的雙酶切鑒定（EcoRⅠ/BamHⅠ）2.4誘餌蛋白的自激活檢測

圖4 GINS2蛋白的自激活檢測

陰性對照、陽性對照及誘餌質(zhì)粒組轉(zhuǎn)化的菌落可在SD/-Trp/-Leu缺陷平板正常生長，僅有陽性對照組轉(zhuǎn)化的菌落可在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上生長，而陰性對照及誘餌質(zhì)粒組不生長，表明報(bào)告基因His3、Ade2未被激活。報(bào)告基因LacZ的檢測結(jié)果與陰性對照....

本文編號：4053196