發(fā)布時(shí)間：2025-06-24 00:36

　　 目的建立一個(gè)穩(wěn)定、高效檢測(cè)眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌的體系。方法采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù),由0.1～0.2 mL眼內(nèi)平衡鹽溶液(BSS)模擬眼內(nèi)房水或玻璃體,利用銅綠假單胞菌gbca基因,特異性設(shè)計(jì)5組LAMP引物,并對(duì)擴(kuò)增方法進(jìn)行關(guān)鍵試劑的優(yōu)化,檢測(cè)眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌。結(jié)果該擴(kuò)增方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化后,最低可以檢出100 fg/μL純基因組DNA,接近熒光定量靈敏度,具有很好的重現(xiàn)性。此外該方法在檢測(cè)眼內(nèi)液中混合的菌落時(shí)呈現(xiàn)出良好的檢測(cè)效果,可以檢測(cè)出2.1×10～2 CFU/mL,極具應(yīng)用價(jià)值。結(jié)論建立了一個(gè)穩(wěn)定、高效、靈敏的恒溫?cái)U(kuò)增體系,可以應(yīng)用于眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌的檢測(cè)。

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【部分圖文】：

圖1 銅綠假單胞菌的擴(kuò)增引物篩選。

如圖1所示,從5組引物中最終篩選出第3組引物,其陰性擴(kuò)增不出峰,陽(yáng)性反應(yīng)出峰時(shí)間在30min之前。將其和常見(jiàn)5種眼內(nèi)炎微生物進(jìn)行交叉擴(kuò)增,沒(méi)有出峰,最終確定該組引物可用于后續(xù)的靈敏度檢測(cè)和眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌檢測(cè)。2.2實(shí)時(shí)LAMP體系

圖2 銅綠假單胞菌LAMP體系優(yōu)化

鎂離子的濃度和Bst酶的活性有著很高的相關(guān)性,最適合的鎂離子濃度是高效反應(yīng)的關(guān)鍵。在具體的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,首先按照標(biāo)準(zhǔn)體系對(duì)額外的鎂離子濃度為基準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化,分別在對(duì)應(yīng)核酸的陰性擴(kuò)增反應(yīng)和陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)中加入0.1mol/L硫酸鎂0、1、2、3μL,比較其差別,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖見(jiàn)額外....

圖3 銅綠假單胞菌的LAMP檢測(cè)靈敏度

將銅綠假單胞菌的基因組DNA以?xún)?yōu)化擴(kuò)增條件時(shí)的核酸濃度向下稀釋108倍,結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可以看出,優(yōu)化后的LAMP體系(10×ThermoPolReactionBuffer2.5μL,10mmol/LdNTPs3.5μL,引物Mix1μL,0.1mol/....

圖4 實(shí)時(shí)qPCR靈敏度

對(duì)銅綠假單胞菌核酸稀釋實(shí)驗(yàn),可以發(fā)現(xiàn)LAMP方法在銅綠假單胞檢測(cè)體系的檢測(cè)限大約是100fg/μL。為了驗(yàn)證該擴(kuò)增方法的準(zhǔn)確性,我們選擇通用的實(shí)時(shí)qPCR法對(duì)上述9個(gè)濃度梯度的核酸進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖4,實(shí)時(shí)qPCR法可以檢測(cè)1fg/μL。2.5灌注液中銅綠假單胞菌的靈敏度檢....

本文編號(hào)：4052234