發(fā)布時間：2020-11-03 23:28

　　 豆科植物不僅種類繁多而且分布廣泛,由于絕大多數(shù)豆科植物可以與土壤中的根瘤菌形成互利共生的關系,并且通過共生固氮滿足自身對于氮素營養(yǎng)的大部分需求。Sinorhizobium fredii Q8菌株是從陜西省楊凌區(qū)農田土壤中分離得到的一株根瘤菌,與西北地區(qū)廣泛種植的大豆中黃13品種具有優(yōu)良的結瘤和固氮性能。本文以S.fredii Q8以及大豆中黃13品種為主要研究材料,通過轉錄組、基因敲除及互補,結合熒光探針觀察等方法研究H_2S信號分子及其代謝酶在S.fredii Q8與大豆植株結瘤和固氮過程中的作用及其發(fā)揮作用的機制。首先,使用NaHS作為外源H_2S供體處理大豆植株后,植株根部以及根瘤內的H_2S含量有了較為明顯的增加。同時在接種根瘤菌S.fredii Q8之后,大豆植株在經過NaHS處理之后植株的長勢有了顯著的提高,根長、株高、地上部分以及根部的干重都有了顯著增加。光合作用速率以及葉綠素熒光參數(shù)的測量表明,經過NaHS處理的植株葉片中,葉綠素含量以及凈光合速率都高于對照組植株。在共生能力方面,經過外源H_2S處理的大豆植株的結瘤數(shù)量也顯著高于對照組植株。不僅如此,外源H_2S處理還促進了大豆根瘤的固氮能力,固氮酶活性測定結果顯示經過NaHS處理的大豆植株所結根瘤內部的固氮酶活性要顯著高于未處理的對照組根瘤。而qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),外源H_2S處理可以促進共生相關基因如根瘤菌nodA、nodC、nodD以及大豆根部GmENOD40、GmERN、GmNSP2b、GmNIN1a/2a/2b的表達。此外,與氮代謝相關的GmGOGAT、GmAS、GmNiR、GmSAT1、GmLb等基因的表達量也在經過NaHS處理的植株根部有所上調。這些結果說明外源H_2S處理可以促進S.fredii Q8與大豆植株的共生與結瘤,并且對大豆根瘤的固氮能力具有促進作用。由于固氮作用的提升,大豆植株的氮素供應較為充足,這也促進了葉綠素的合成以及光合作用的進行,從而提高了大豆植株的碳同化能力,最終使得大豆植株的長勢得到促進。其次,通過H_2S特異性熒光探針觀察后發(fā)現(xiàn),在大豆根瘤的固氮區(qū)有大量內源H_2S產生。將S.fredii Q8編碼cystathionineγ-lyase(CSE)的CSE基因敲除之后,?CSE突變體根瘤菌內源H_2S的產量顯著降低,并且用?CSE菌株接種大豆植株形成的根瘤內部H_2S的產生也受到了明顯的抑制。在接種?CSE菌株的大豆根瘤中,不僅內源H_2S含量較低,固氮酶活性也顯著低于接種野生型菌株WT以及互補菌株Cp?CSE所形成的根瘤。透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn),雖然?CSE根瘤的外部形態(tài)和大小與WT菌株所結根瘤沒有顯著差異,但是固氮區(qū)根瘤細胞內類菌體以及共生體膜的形態(tài)都發(fā)生了與氧化脅迫條件下相似的變化。不僅如此,內源H_2S的不足還會導致根瘤中過氧化氫等活性氧分子(ROS)的積累和氧化損傷的出現(xiàn)。與此同時,H_2S含量降低也促進編碼抗氧化酶基因的表達以及酶活性的增加。這些結果說明,大豆根瘤的內源H_2S可以通過其抗氧化作用維持大豆根瘤內的固氮酶活性,促進大豆的共生固氮作用。最后,根瘤菌的3-mercaptopyruvate sulfurtransferase(3MST)對于S.fredii Q8對大豆中黃13品種的侵染能力也具有很顯著的影響。將編碼3MST的sseA基因敲除之后,?3MST菌株與大豆中黃13植株共生所形成的根瘤雖然數(shù)量明顯增加,但都是豆血紅蛋白含量極低而且?guī)缀鯖]有固氮能力的無效根瘤。石蠟切片和透射電鏡觀察根瘤的顯微結構以及超微結構發(fā)現(xiàn),?3MST菌株在根瘤細胞內的侵染和定殖能力受到了破壞,類菌體數(shù)量極少而且形態(tài)出現(xiàn)了明顯的畸形。同時,3MST的缺失還會抑制S.fredii Q8 III型分泌系統(tǒng)與結瘤相關的效應蛋白NopX的分泌。通過轉錄組分析發(fā)現(xiàn),在接種?3MST菌株后1h與3h內差異表達基因較多。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),接種?3MST菌株與接種WT菌株對植物的與病原物互作通路中的基因的表達影響最為顯著。通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn),在接種WT菌株后1 h,大豆植株根部的與病原物相關的防御基因的表達會被抑制,而在接種?3MST菌株的大豆中,這些與病原物防御反應相關的基因的表達不僅沒有受到明顯的抑制,少數(shù)防御基因的表達量還會出現(xiàn)上調的情況。
【學位單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

根瘤的類型是由豆科宿主本身所決定的。定型根層細胞起始分裂的位置、根瘤內分生組織的存在nd Gresshoff, 1988; Newcomb et al., 1979)。不定細胞，隨后中柱鞘以及皮層外層的細胞才開始定型根瘤中會一直存在分生區(qū)，可以不斷分裂產導致了不定型根瘤的性狀通常為棒狀(Bond, 1al., 1979)。成熟之后的不定型根瘤，由于分生組在根瘤內部產生四個不同的分區(qū)：分生區(qū)、侵染瘤中的維管束的分支相比于定型根瘤也相對較分生組織，根瘤的外形為圓形，內部也沒有形成n and Bauer, 1982)。初始的細胞分裂位置在接近l., 2010)。成熟之后的定型根瘤內部的侵染細胞以育和衰老，這也就導致了定型根瘤的壽命只有短有新的根瘤產生來代替衰老的根瘤(B G Rolfe的產生過程示意圖見圖 1-1.

為與調控結瘤數(shù)量有關。比如 LjKLAVIER 基因就可以調節(jié)百脈根的結a-Kira E, 2010)。LjASTRAY 基因通常被認為與百脈根植株的光調節(jié)有關imura R (2002)發(fā)現(xiàn)這個基因在缺失突變之后，百脈根植株的結瘤數(shù)也會增truncatula 中，MtEFD 是 MtERF 的轉錄調節(jié)因子，當 MtEFD 基因發(fā)生突變植株會表現(xiàn)出結瘤數(shù)增加的性狀(Vernie et al., 2008)。這些基因對于結瘤數(shù)定的負調節(jié)作用，但是其作用機制是直接參與 AON 途徑或者通過其他途徑數(shù)量尚不清楚。乙烯作為一種植物激素，不僅可以促進果實的成熟和花的衰老(G H Kraus, 2003),還可以在豆科植物中控制結瘤的數(shù)量(Ferguson and Mathesius, 2003;Geil, 2002)。在遭遇逆境脅迫條件下，植株自身往往會產生大量的乙烯，這通過降低結瘤的數(shù)量來避免植物在不利的生長環(huán)境中將過多的能量和碳源進行共生固氮。當植物的乙烯受體發(fā)生功能的缺失時植株會出現(xiàn)結瘤數(shù)量。比如當百脈根的乙烯受體 LjETR1 和 LjEIN2 被敲除之后，突變體的結瘤(Lohar et al., 2009)。當蒺藜苜蓿的乙烯受體 MtEIN2 基因發(fā)生突變后，突變同樣出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象(Varma Penmetsa et al., 2008)。

氫（H2S）信號在植物中的研究進展氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸的重要組成成分，以及輔因子、多的重要元素，對所有生物都是必不可少的。植物作為同化者，同化方式將氧化硫酸鹽形式的無機硫還原成有機態(tài)的硫供自kahashi et al., 2010)。因此，植物利用硫的第一步是通過硫酸鹽鹽。一旦進入表皮，絕大多數(shù)的硫酸鹽會通過細胞間的胞間連管束中向外運輸以避免硫酸鹽的積累，也會有部分的硫酸鹽透。一旦進入細胞質中，硫酸鹽或者儲存在細胞的液泡中，或者Takahashi, 2015; Takahashi et al., 2010)。利用 ATP 水解釋放的能活化形成腺苷 5 -磷酸硫酸鹽（APS）。該反應由 ATP 硫酰化物中，所形成的的 APS 可以通過 APS 還原酶（APR）直接被硫酸鹽進一步被氧還蛋白依賴型的亞硫酸鹽還原酶（SiR）還被合稱為乙酰絲氨酸（OAS）并最終參與半胱氨酸的合成。這酸鹽通過還原同化進入植物初級代謝的途徑，見圖（1-3）。

本文編號：2869255