CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌ATCC 14067基因組編輯中的研究
發(fā)布時間：2020-12-19 06:31
谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）在微生物發(fā)酵工業(yè)上具有很大的應用潛力,可以通過代謝工程來生產(chǎn)多種氨基酸,而基因組編輯技術在其代謝工程中發(fā)揮著重要的作用。在谷氨酸棒桿菌中,傳統(tǒng)的基因組編輯技術都存在著重組效率低,耗費時間長等缺點,難以滿足工業(yè)菌株改造的需求。此外,由于不同菌株之間的基因組差異,導致基因組編輯技術的適用性也存在一定的限制,例如SacB反向篩選系統(tǒng)并不適用于谷氨酸棒桿菌ATCC 14067,因此仍需進一步來探究新的基因組編輯技術�；诖�,本研究以谷氨酸棒桿菌ATCC 14067為研究對象,初步建立了基于CRISPR/Cpf1的基因組編輯系統(tǒng),并進一步通過不同PAM和可編輯位點范圍的探究優(yōu)化了該系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的應用,然后將其成功應用于谷氨酸棒桿菌的多基因同時編輯和DNA大片段的刪除上。該技術有效完善了谷氨酸棒桿菌ATCC 14067的基因組修飾系統(tǒng),為其代謝途徑的改造奠定了夯實的基礎。具體研究內(nèi)容及結果如下:（1）谷氨酸棒桿菌ATCC 14067中基于CRISPR/Cpf1的基因組編輯技術的建立與優(yōu)化首先通過測試雙質粒（pJYS1Pta...
【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：83 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
谷氨酸棒桿菌應用于多種化合物的生產(chǎn)Fig.1-1Corynebacteriumglutamicumusedintheproductionofvariouscompounds
測性和調節(jié)性；阻斷一些非必需的代謝途徑可以有助于提高細胞轉化靶向生物制品的率；強化一些必需的代謝途徑可以大大提高細胞轉化靶向生物制品的效率。在早期的十幾年中，基于兩輪同源重組的 SacB 反向篩選系統(tǒng)已廣泛應用于谷氨棒桿菌的基因組工程中，該系統(tǒng)利用果聚糖酶 SacB（SacB 能夠將蔗糖分解為葡萄糖果糖，并將果糖聚合為果聚糖，對谷氨酸棒桿菌有致死性）作為反向篩選標記，經(jīng)過輪單交換完成靶標基因的編輯。但該系統(tǒng)是通過菌株自身的同源重組系統(tǒng)來完成兩次交換，重組效率較低，且陽性轉化子的概率＜50%[14-16]。此外，Cre/loxP 重組系統(tǒng)也泛應用于谷氨酸棒桿菌基因組上 DNA 片段的敲除和替換[17]。Cre/loxP 重組系統(tǒng)是由 C重組酶和其所識別的兩個 loxP 位點共同組成，Cre 酶介導兩個 loxP 位點完成分子內(nèi)組，使 loxP 位點間的序列被剪切，并留下 1 個 loxP 位點。而對應的 Cre/mutant lox 系是將 loxP 位點改造為突變的 lox71、lox66 序列，二者之間的序列被 Cre 酶切割后，留不被 Cre 酶識別的突變 lox72 序列，可用于基因片段的連續(xù)無痕敲除[18]。然而，該方也是費力耗時的，仍需進一步開發(fā)新的基因組編技術。
華南理工大學碩士學位論文RecFACS 方法中，異源基因整合到染色體中是基于多重自動化基因組工程概念，其中使用由不同噬菌體編碼的同源重組蛋白將單鏈 DNA 直接引入細菌染色體中。突變體的篩選是通過快速自動熒光激活細胞分選（FACS）完成。然而，RecFACS 方法需要構建靶基因特異性生物傳感器和 FACS 用于菌落篩選，妨礙其在系統(tǒng)基因組工程中的應用[19]。此外，在我們之前的研究中，通過在谷氨酸棒桿菌 ATCC 14067 中優(yōu)化外源核酸外切酶-重組酶對 RecET 協(xié)助外源線性 dsDNA 重組的條件，提高了 RecET 在谷氨酸棒桿菌中的重組效率；建立 RecET 介導的自我切割線性雙鏈 DNA 的重組系統(tǒng)（RecET-Cre/lox系統(tǒng)），實現(xiàn)了基因組上靶標基因的連續(xù)無痕敲除，其基因敲除的效率高達 94%以上[20]。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于CRISPR系統(tǒng)基因編輯與基因調控技術的發(fā)展[J]. 楊明輝,陶景麗,柴孟龍,吳昊,連正興,劉國世. 農(nóng)業(yè)生物技術學報. 2018(02)
[2]新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1[J]. 楊帆,李寅. 生物工程學報. 2017(03)
博士論文
[1]谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途徑的反饋抑制機制解析及其代謝工程改造[D]. 黃園園.華南理工大學 2018
碩士論文
[1]谷氨酸棒狀桿菌基因敲除系統(tǒng)的構建[D]. 譚延振.江南大學 2012
本文編號：2925437
【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：83 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
谷氨酸棒桿菌應用于多種化合物的生產(chǎn)Fig.1-1Corynebacteriumglutamicumusedintheproductionofvariouscompounds
測性和調節(jié)性；阻斷一些非必需的代謝途徑可以有助于提高細胞轉化靶向生物制品的率；強化一些必需的代謝途徑可以大大提高細胞轉化靶向生物制品的效率。在早期的十幾年中，基于兩輪同源重組的 SacB 反向篩選系統(tǒng)已廣泛應用于谷氨棒桿菌的基因組工程中，該系統(tǒng)利用果聚糖酶 SacB（SacB 能夠將蔗糖分解為葡萄糖果糖，并將果糖聚合為果聚糖，對谷氨酸棒桿菌有致死性）作為反向篩選標記，經(jīng)過輪單交換完成靶標基因的編輯。但該系統(tǒng)是通過菌株自身的同源重組系統(tǒng)來完成兩次交換，重組效率較低，且陽性轉化子的概率＜50%[14-16]。此外，Cre/loxP 重組系統(tǒng)也泛應用于谷氨酸棒桿菌基因組上 DNA 片段的敲除和替換[17]。Cre/loxP 重組系統(tǒng)是由 C重組酶和其所識別的兩個 loxP 位點共同組成，Cre 酶介導兩個 loxP 位點完成分子內(nèi)組，使 loxP 位點間的序列被剪切，并留下 1 個 loxP 位點。而對應的 Cre/mutant lox 系是將 loxP 位點改造為突變的 lox71、lox66 序列，二者之間的序列被 Cre 酶切割后，留不被 Cre 酶識別的突變 lox72 序列，可用于基因片段的連續(xù)無痕敲除[18]。然而，該方也是費力耗時的，仍需進一步開發(fā)新的基因組編技術。
華南理工大學碩士學位論文RecFACS 方法中，異源基因整合到染色體中是基于多重自動化基因組工程概念，其中使用由不同噬菌體編碼的同源重組蛋白將單鏈 DNA 直接引入細菌染色體中。突變體的篩選是通過快速自動熒光激活細胞分選（FACS）完成。然而，RecFACS 方法需要構建靶基因特異性生物傳感器和 FACS 用于菌落篩選，妨礙其在系統(tǒng)基因組工程中的應用[19]。此外，在我們之前的研究中，通過在谷氨酸棒桿菌 ATCC 14067 中優(yōu)化外源核酸外切酶-重組酶對 RecET 協(xié)助外源線性 dsDNA 重組的條件，提高了 RecET 在谷氨酸棒桿菌中的重組效率；建立 RecET 介導的自我切割線性雙鏈 DNA 的重組系統(tǒng)（RecET-Cre/lox系統(tǒng)），實現(xiàn)了基因組上靶標基因的連續(xù)無痕敲除，其基因敲除的效率高達 94%以上[20]。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于CRISPR系統(tǒng)基因編輯與基因調控技術的發(fā)展[J]. 楊明輝,陶景麗,柴孟龍,吳昊,連正興,劉國世. 農(nóng)業(yè)生物技術學報. 2018(02)
[2]新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1[J]. 楊帆,李寅. 生物工程學報. 2017(03)
博士論文
[1]谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途徑的反饋抑制機制解析及其代謝工程改造[D]. 黃園園.華南理工大學 2018
碩士論文
[1]谷氨酸棒狀桿菌基因敲除系統(tǒng)的構建[D]. 譚延振.江南大學 2012
本文編號：2925437
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