發(fā)布時間：2025-04-11 02:59

　　 本研究在實驗室前期構(gòu)建的敲除α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)基因的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(FUT8-/--CHO-S)基礎上,建立了穩(wěn)定表達IgG1型抗HER2單克隆抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。以曲妥珠單抗為模式蛋白,構(gòu)建了帶有嘌呤霉素抗性基因的表達載體pIRES-HC和pIRES-LC,并用電穿孔法共轉(zhuǎn)染入FUT8-/--CHO-S細胞,通過嘌呤霉素加壓培養(yǎng)、Dot Blot和WesternBlot等檢測方法,經(jīng)過兩輪有限稀釋篩選出了高表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。該細胞株在批次培養(yǎng)(Batch)中最高生長密度達每毫升6.05×106個,抗體產(chǎn)量為168 mg/L。在補料培養(yǎng)(Fed-Batch)中,通過補料CHO Feed4的添加,最高生長密度提高到每毫升17.1×106個,抗體產(chǎn)量達到437 mg/L,試驗結(jié)果表明改造的FUT8-/--CHO-S細胞株具有開發(fā)成工業(yè)細胞株的潛力。

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

圖2M-Marker；1-轉(zhuǎn)染細胞上清；2-曲妥珠單抗(陽性對照，25ng/μl)；3-未轉(zhuǎn)染細胞上清(陰性對照)

stableandhighexpressioncellclonehigherproductionbyapplyingaFed-Batchstrategyα-1,6-fucosyltransferase(FUT8)geneknockoutCHO-Scellsclonalcellis....

圖3檢測(陽性對照-曲妥珠單抗，上樣量2μl)，B：挑選的單克隆細胞抗體表達的WesternBlot檢測M-Marker；1-曲妥珠單抗(25ng/μl)；2～37-36株單克隆細

養(yǎng)，取等量細胞上清用WesternBlot進一步檢測蛋白表達情況(圖3B)，篩選出高表達的初始細胞株后，用有限稀釋法進行第二輪篩眩重復上述篩選步驟，并對得到的高表達亞克隆細胞進行懸浮馴化培養(yǎng)，得到最終的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。陽性對照陽性對照M1234567....

圖4A：細胞生長曲線(n=3)，B：細胞上清ProteinA純化的SDS-PAGE檢測M-Marker；1-細胞上清；2-流穿液；3、4、6-洗脫得到的蛋白樣品；5-曲妥珠單抗

－補料EfficientFeedA；○－補roporationsfectionselectionwithpuromycin3weekswithnA8060402010080604020012345678細胞活率/%活細胞密度/×10個5-活細胞密度；-細胞活率培養(yǎng)時間/d非還原還....

本文編號：4039397