發(fā)布時(shí)間：2025-05-13 05:53

　　DNA聚合酶是普遍存在于生物體內(nèi)執(zhí)行DNA復(fù)制的關(guān)鍵酶。隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展,越來越多的DNA聚合酶被發(fā)現(xiàn)并逐漸應(yīng)用于包括PCR、定點(diǎn)誘變、高通量測序在內(nèi)的生物學(xué)研究。在眾多的DNA聚合酶中,來自B族的古菌DNA聚合酶因?yàn)榫哂辛己玫臒岱�(wěn)定性、超群的保真性、一定的可加工性而受到越來越多研究者的歡迎。本文所研究的來自超嗜熱古菌Thermococcus kodakarensis的KOD DNA聚合酶就屬于這一家族,但市售的KOD DNA聚合酶產(chǎn)品大多來自于國外的公司,受到進(jìn)口和專利等限制,價(jià)格較為昂貴。因此,開發(fā)出一種具有優(yōu)良特性且價(jià)格有優(yōu)勢的KOD DNA聚合酶就顯得尤為重要。本文利用Escherichia coli重組表達(dá)了KOD DNA聚合酶并對其生物活性進(jìn)行了表征;同時(shí)通過定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了KOD DNA聚合酶突變體,也對其生物活性進(jìn)行表征;對重組KOD DNA聚合酶在PCR的應(yīng)用過程中,通過添加了解旋酶或分子伴侶素的方法,構(gòu)建PCR復(fù)合酶體系,針對PCR反應(yīng)特異性、儲存穩(wěn)定性、損傷修復(fù)性進(jìn)行研究,研究結(jié)果表明:在E.coli中表達(dá)出的重組KOD DNA聚合酶濃度最高可達(dá)5.4...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1 KOD DNA聚合酶-模板-d ATP三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)[18]

KODDNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為幾個(gè)部分,5’-3’聚合酶活性部分執(zhí)行酶的催化聚合功能,3’-5’外切酶活性部分實(shí)行校對功能。KODDNA聚合酶可分為以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)域,N端(N-terminal)由第1-130,327-368位氨基酸組成;外切酶結(jié)構(gòu)域(exonucleas....

圖2.1 KOD DNA聚合酶CDS

從NCBI中獲取KODDNA聚合酶基因的CDS(蛋白質(zhì)編碼序列),共2325bp,如圖2.1,利用NEBcutter2.0等軟件對目的基因進(jìn)行分析設(shè)計(jì),于基因5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)NdeⅠ(CATATG),于基因3’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)BamHⅠ(GGATCC),擬將該基因插入至pE....

圖2.2 KOD DNA聚合酶基因優(yōu)化后序列

根據(jù)E.coli表達(dá)偏好性,針對KODDNA聚合酶基因進(jìn)行優(yōu)化,圖2.2為合成公司反饋的優(yōu)化結(jié)果。2.3.2重組KODDNA聚合酶的表達(dá)

圖2.3 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)KOD DNA聚合酶

重組KODDNA聚合酶的表達(dá)結(jié)果如圖2.3所示。箭頭指示為目標(biāo)蛋白。誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后對比結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后的菌體在94kDa下方多了一條明顯的條帶,而目的蛋白大小約為91kDa,說明KODDNA聚合酶在經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后有明顯特異性表達(dá);總蛋白與上清液中蛋白含量的對比顯示,....

本文編號：4045841