發(fā)布時間：2018-01-05 07:29

  本文關鍵詞：桃柁酚抗金黃色葡萄球菌的活性及機制研究　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：據(jù)報道,食源性致病菌如金葡菌(金葡菌)引起的食品污染對人類的身體健康造成了嚴重的威脅。金葡菌能夠引起食源性疾病和食物中毒,這與社會公共健康密切相關,并且這一領域在近年來受到越來越多的關注。此外,金葡菌還能夠引起一系列的感染,這也是全球主要關心的問題。金葡菌產生多種毒力蛋白,進而導致感染和食物中毒。這些毒性蛋白包括透明質酸酶,蛋白酶,凝固酶,脂酶,脫氧核糖核酸酶以及腸毒素等。在這些由金葡菌產生的毒力蛋白中,外毒素α-溶血素,葡萄球菌腸毒素A(SEA)和葡萄球菌腸毒素B(SEB)在一定意義上被認為是導致致病性的主要原因。桃柁酚,一種從羅漢松中提取出來的傳統(tǒng)的中草藥,是一種新穎的抗菌酚二萜,有報道發(fā)現(xiàn)桃柁酚能夠有效地抑制一些病原體的擴散。然而,并沒有報告指出桃柁酚對金葡菌產生的α-溶血素,SEA和SEB分泌的影響,且桃柁酚抗金葡菌的抗菌機制也尚未清楚。因此,在這項研究中,我們的第一個目的就是評估桃柁酚這三個外毒素分泌的影響,另外,桃柁酚對金葡菌的抗菌活性和抗菌機制-膜破損機制也被探究出來。桃柁酚能夠在低劑量的條件下抑制金葡菌的生長繁殖,并且可以抑制的外毒素的分泌產生。此外,桃柁酚通過破壞細菌的細胞膜的作用方式進行抗菌,破壞菌體細胞膜,導致細胞死亡。桃柁酚對金葡菌的MIC值已經通過實驗確定,我們得出的結論是,桃柁酚對對金葡菌菌株的MIC值為2 4μg/m L。而對于金葡菌標準株ATCC 29213,桃柁酚對其MIC值是2μg/m L。時間-殺菌曲線的實驗測定結果表明,桃柁酚能夠在實驗室條件下和食品模型中抑制金葡菌的生長,且呈現(xiàn)劑量依賴性。在每個時間點,在0.25μg/m L的桃柁酚濃度下,金葡菌的菌落數(shù)并沒有明顯減少,然后在0.5μg/m L的桃柁酚濃度下金葡菌的菌落數(shù)開始明顯減少,在1μg/m L的桃柁酚濃度下金葡菌的菌落數(shù)開始最大幅度的減少。在溶血試驗中,與空白對照組相比較,當加入終濃度為0.25、0.5和1μg/m L的桃柁酚時,溶血的比例分別降低至95.6%,81.5%和26.5%。桃柁酚抑制金葡菌菌上清的溶血能力呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。蛋白免疫印跡實驗western blot的結果表明亞抑菌濃度下的桃柁酚能夠有效地抑制外毒素α-溶血素,SEA和SEB的分泌,并呈現(xiàn)劑量依賴性的方式。如我們預期一樣,桃柁酚也能夠顯著降低金葡菌ATCC 29213外毒素基因Sar A,agr A,hla,sea和seb的轉錄水平,也呈現(xiàn)出劑量依賴性。此外,隨著亞抑菌濃度下桃柁酚對金葡菌菌懸液的劑量不斷增加,RAW 264.7細胞中TNF-α釋放的水平也逐漸減少。菌體細胞內胞質內容的泄漏是一個典型的證據(jù)能夠表明細菌細胞質膜已經受到破壞。因此,電導率測定實驗的數(shù)據(jù)結果表明,桃柁酚處理金葡菌菌懸液之后,上清液的電導率有了不同程度的增加,進而說明,不同濃度的桃柁酚對金葡菌菌體細胞膜產生了破壞作用,嚴重的影響了都細菌細胞膜的完整性。此外,我們發(fā)現(xiàn)桃桃柁酚能夠減少金葡菌細胞質中β-半乳糖苷酶的產生。而SDS-PAGE實驗和瓊脂糖凝膠電泳實驗的結果分析表明,桃柁酚能夠對金葡菌菌體細胞質膜造成不可逆的損害,并通過滲透和破壞細胞膜,使得菌體內的細胞可溶性蛋白質和核酸減少,最終導致細胞死亡。當金葡菌菌體遇到合適的抗菌劑的時候,金葡菌細胞壁表面惡化,金葡菌菌體的生理變化和形態(tài)也隨之發(fā)生變化。SEM實驗觀察表明當桃柁酚作用于細菌細胞時,在不同的作用時間,細胞變得畸形,產生褶皺,凹凸不平,甚至有些細胞腫脹,從而引起營養(yǎng)物質和遺傳物質的浸出。經TEM分析實驗結果表明,桃柁酚造成金葡菌細胞結構的重大損害包括細胞膜和細胞質,這也最終導致了細菌細胞快速溶解和死亡。從這些實驗數(shù)據(jù)中可得出結論,我們的實驗結果不僅提供了額外的證據(jù)支持桃柁酚是一種天然的抗菌劑,清楚了桃柁酚抗金葡菌的抑菌機制。因此,我們建議桃柁酚可能作為一種很有前途的天然化合物應用于在食品工業(yè)和制藥工業(yè)。
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本文編號：1382156