發(fā)布時間：2020-12-25 19:43

　　近年來,環(huán)境雌激素對野生動物生殖系統(tǒng)的危害受到了研究者的廣泛關(guān)注,為了篩選出具有雌激素活性的化學物質(zhì),OECD與美國EPA建立了以魚類為受試生物,以卵黃原（Vitellogenin, Vtg）為主要指標的篩選測試導則。斑馬魚（Danio rerio）是導則中推薦的重要模式魚種之一,其Vtg的檢測多采用導則中推薦的兩種不同的酶聯(lián)免疫吸附實驗方法（ELISA）。Vtg誘導量的準確測定是正確評價化合物雌激素活性的重要前提,然而目前常用的測定方法和實驗用魚都可能會干擾Vtg的準確定量。為了確定高穩(wěn)定性、高敏感性的斑馬魚Vtg ELISA檢測方法,本研究對實驗所用的抗原、抗體以及實驗的方案、操作步驟進行了比較與優(yōu)化;為了確定合適的實驗用魚,本研究檢測了母源卵黃蛋白與新生成Vtg在斑馬魚發(fā)育過程中的變化情況,以尋找不含有Vtg的發(fā)育時期。此外,本研究還利用Octet生物分子相互作用系統(tǒng)建立了斑馬魚Vtg的生物傳感器技術(shù),為環(huán)境雌激素的篩選提供了簡便、快捷的檢測手段。本研究首先分離純化了斑馬魚Vtg與卵黃脂磷蛋白（lipovitellin, Lv）,分析了它們的糖磷脂基團、分子量、氨基酸組成等基本性... 

【文章來源】：中國海洋大學山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
0 前言
1 抗體技術(shù)在環(huán)境雌激素檢測中的應(yīng)用研究進展
    1.1 魚類卵黃原蛋白與卵黃蛋白的性質(zhì)研究進展
        1.1.1 卵黃原蛋白的生成與酶解
        1.1.2 卵黃原蛋白與卵黃蛋白的免疫原性研究
        1.1.3 卵黃原蛋白與卵黃脂磷蛋白的生化性質(zhì)比較
    1.2 抗體技術(shù)在卵黃原蛋白檢測中的應(yīng)用
        1.2.1 單向免疫擴散
        1.2.2 化學發(fā)光免疫
        1.2.3 放射性免疫
        1.2.4 免疫印跡
        1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗
        1.2.6 免疫膠體金技術(shù)
        1.2.7 免疫傳感器技術(shù)
    1.3 研究展望
        1.3.1 建立準確定量Vtg的實驗方案
        1.3.2 尋找高穩(wěn)定性的標準品
        1.3.3 開發(fā)新型的生物標志物
        1.3.4 多種方法在Vtg檢測中的聯(lián)合應(yīng)用
    1.4 研究目的和技術(shù)路線
2 斑馬魚Vtg ELISA建立、比較與斑馬魚Vtg空白期的確定
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗藥品與儀器
        2.1.2 生物材料
        2.1.3 實驗方法
        2.1.4 數(shù)據(jù)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 卵黃原蛋白的純化與鑒定
        2.2.2 抗血清效價的測定
        2.2.3 抗體的特異性
        2.2.4 抗體的純化與鑒定
        2.2.5 斑馬魚Vtg兩種ELISA的建立與比較
        2.2.6 卵黃蛋白與Vtg在發(fā)育過程中的變化
2暴露后斑馬魚幼魚體內(nèi)Vtg的含量測定">        2.2.7 E₂暴露后斑馬魚幼魚體內(nèi)Vtg的含量測定
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
3 基于卵黃脂磷蛋白建立高穩(wěn)定性的斑馬魚卵黃原蛋白夾心ELISA
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗藥品與儀器
        3.1.2 生物材料
        3.1.3 實驗方法
        3.1.4 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 卵黃脂磷蛋白的性質(zhì)鑒定
        3.2.2 抗血清效價的測定
        3.2.3 抗體的特異性分析
        3.2.4 夾心ELISA的建立
        3.2.5 久效磷對斑馬魚幼魚Vtg的誘導
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
4 基于卵黃脂磷蛋白單克隆抗體構(gòu)建斑馬魚卵黃原蛋白夾心ELISA
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗藥品與儀器
        4.1.2 生物材料
        4.1.3 實驗方法
        4.1.4 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 單克隆抗體的制備
        4.2.2 抗體的特異性檢測
        4.2.3 抗體的鑒定
        4.2.4 夾心ELISA的建立
2暴露下斑馬魚幼魚Vtg的含量測定">        4.2.5 E₂暴露下斑馬魚幼魚Vtg的含量測定
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
5 利用Octet生物分子相互作用系統(tǒng)建立斑馬魚卵黃原蛋白的快速檢測方法
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗藥品與儀器
        5.1.2 生物材料
        5.1.3 實驗方法
        5.1.4 數(shù)據(jù)分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 標準曲線的建立
        5.2.2 樣品中Vtg的測定
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
6 結(jié)論與創(chuàng)新點
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
參考文獻
縮略詞表
致謝
個人簡歷
發(fā)表的學術(shù)論文
已授權(quán)的發(fā)明專利
已受理的發(fā)明專利


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]瓦氏黃顙魚卵黃脂磷蛋白(Lv)的純化、性質(zhì)鑒定及其抗血清的研制[J]. 李育培,刁曉明,盛曉灑,權(quán)恒,翟旭亮,李云.  水產(chǎn)學報. 2010(01)
[3]一種能原位檢測類雌激素暴露的膠體金免疫檢測試片[J]. 楊方星,徐盈.  生態(tài)毒理學報. 2007(02)
[4]美國紅魚卵黃原蛋白的分離純化及電泳性質(zhì)鑒定[J]. 李穎,汝少國,邴欣.  應(yīng)用與環(huán)境生物學報. 2007(01)
[5]免疫傳感器用于環(huán)境中痕量有害物質(zhì)檢測的研究進展[J]. 湯琳,曾光明,黃國和,牛承崗.  環(huán)境科學. 2004(04)
[6]兔抗甲胺磷多克隆抗體的制備[J]. 董國偉,王沫,劉賢進,余向陽.  華中農(nóng)業(yè)大學學報. 2001(04)

博士論文
[1]金魚卵黃原蛋白多克隆抗血清制備及在內(nèi)分泌擾亂化學物質(zhì)檢測中的應(yīng)用[D]. 邴欣.中國海洋大學 2006



本文編號：2938277