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斑馬魚(yú)卵黃原蛋白單/多克隆抗體的制備及其在環(huán)境雌激素檢測(cè)中的應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2020-12-25 19:43
  近年來(lái),環(huán)境雌激素對(duì)野生動(dòng)物生殖系統(tǒng)的危害受到了研究者的廣泛關(guān)注,為了篩選出具有雌激素活性的化學(xué)物質(zhì),OECD與美國(guó)EPA建立了以魚(yú)類為受試生物,以卵黃原(Vitellogenin, Vtg)為主要指標(biāo)的篩選測(cè)試導(dǎo)則。斑馬魚(yú)(Danio rerio)是導(dǎo)則中推薦的重要模式魚(yú)種之一,其Vtg的檢測(cè)多采用導(dǎo)則中推薦的兩種不同的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法(ELISA)。Vtg誘導(dǎo)量的準(zhǔn)確測(cè)定是正確評(píng)價(jià)化合物雌激素活性的重要前提,然而目前常用的測(cè)定方法和實(shí)驗(yàn)用魚(yú)都可能會(huì)干擾Vtg的準(zhǔn)確定量。為了確定高穩(wěn)定性、高敏感性的斑馬魚(yú)Vtg ELISA檢測(cè)方法,本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的抗原、抗體以及實(shí)驗(yàn)的方案、操作步驟進(jìn)行了比較與優(yōu)化;為了確定合適的實(shí)驗(yàn)用魚(yú),本研究檢測(cè)了母源卵黃蛋白與新生成Vtg在斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中的變化情況,以尋找不含有Vtg的發(fā)育時(shí)期。此外,本研究還利用Octet生物分子相互作用系統(tǒng)建立了斑馬魚(yú)Vtg的生物傳感器技術(shù),為環(huán)境雌激素的篩選提供了簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)手段。本研究首先分離純化了斑馬魚(yú)Vtg與卵黃脂磷蛋白(lipovitellin, Lv),分析了它們的糖磷脂基團(tuán)、分子量、氨基酸組成等基本性... 

【文章來(lái)源】:中國(guó)海洋大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】:104 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】:博士

【文章目錄】:
摘要
abstract
0 前言
1 抗體技術(shù)在環(huán)境雌激素檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展
    1.1 魚(yú)類卵黃原蛋白與卵黃蛋白的性質(zhì)研究進(jìn)展
        1.1.1 卵黃原蛋白的生成與酶解
        1.1.2 卵黃原蛋白與卵黃蛋白的免疫原性研究
        1.1.3 卵黃原蛋白與卵黃脂磷蛋白的生化性質(zhì)比較
    1.2 抗體技術(shù)在卵黃原蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用
        1.2.1 單向免疫擴(kuò)散
        1.2.2 化學(xué)發(fā)光免疫
        1.2.3 放射性免疫
        1.2.4 免疫印跡
        1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
        1.2.6 免疫膠體金技術(shù)
        1.2.7 免疫傳感器技術(shù)
    1.3 研究展望
        1.3.1 建立準(zhǔn)確定量Vtg的實(shí)驗(yàn)方案
        1.3.2 尋找高穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)品
        1.3.3 開(kāi)發(fā)新型的生物標(biāo)志物
        1.3.4 多種方法在Vtg檢測(cè)中的聯(lián)合應(yīng)用
    1.4 研究目的和技術(shù)路線
2 斑馬魚(yú)Vtg ELISA建立、比較與斑馬魚(yú)Vtg空白期的確定
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器
        2.1.2 生物材料
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1.4 數(shù)據(jù)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 卵黃原蛋白的純化與鑒定
        2.2.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定
        2.2.3 抗體的特異性
        2.2.4 抗體的純化與鑒定
        2.2.5 斑馬魚(yú)Vtg兩種ELISA的建立與比較
        2.2.6 卵黃蛋白與Vtg在發(fā)育過(guò)程中的變化
2暴露后斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)Vtg的含量測(cè)定">        2.2.7 E2暴露后斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)Vtg的含量測(cè)定
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
3 基于卵黃脂磷蛋白建立高穩(wěn)定性的斑馬魚(yú)卵黃原蛋白夾心ELISA
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器
        3.1.2 生物材料
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1.4 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 卵黃脂磷蛋白的性質(zhì)鑒定
        3.2.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定
        3.2.3 抗體的特異性分析
        3.2.4 夾心ELISA的建立
        3.2.5 久效磷對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)Vtg的誘導(dǎo)
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
4 基于卵黃脂磷蛋白單克隆抗體構(gòu)建斑馬魚(yú)卵黃原蛋白夾心ELISA
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器
        4.1.2 生物材料
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1.4 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 單克隆抗體的制備
        4.2.2 抗體的特異性檢測(cè)
        4.2.3 抗體的鑒定
        4.2.4 夾心ELISA的建立
2暴露下斑馬魚(yú)幼魚(yú)Vtg的含量測(cè)定">        4.2.5 E2暴露下斑馬魚(yú)幼魚(yú)Vtg的含量測(cè)定
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
5 利用Octet生物分子相互作用系統(tǒng)建立斑馬魚(yú)卵黃原蛋白的快速檢測(cè)方法
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器
        5.1.2 生物材料
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.4 數(shù)據(jù)分析
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        5.2.2 樣品中Vtg的測(cè)定
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
6 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
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致謝
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已授權(quán)的發(fā)明專利
已受理的發(fā)明專利


【參考文獻(xiàn)】:
期刊論文
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[3]一種能原位檢測(cè)類雌激素暴露的膠體金免疫檢測(cè)試片[J]. 楊方星,徐盈.  生態(tài)毒理學(xué)報(bào). 2007(02)
[4]美國(guó)紅魚(yú)卵黃原蛋白的分離純化及電泳性質(zhì)鑒定[J]. 李穎,汝少國(guó),邴欣.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2007(01)
[5]免疫傳感器用于環(huán)境中痕量有害物質(zhì)檢測(cè)的研究進(jìn)展[J]. 湯琳,曾光明,黃國(guó)和,牛承崗.  環(huán)境科學(xué). 2004(04)
[6]兔抗甲胺磷多克隆抗體的制備[J]. 董國(guó)偉,王沫,劉賢進(jìn),余向陽(yáng).  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2001(04)

博士論文
[1]金魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗血清制備及在內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用[D]. 邴欣.中國(guó)海洋大學(xué) 2006



本文編號(hào):2938277

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