發(fā)布時間：2021-03-15 09:31

  第一部分鼻咽癌復發(fā)相關血清腫瘤標志物的篩選背景和目的鼻咽癌常是具有中國特色的腫瘤,廣西、廣東、福建等地是鼻咽癌高發(fā)區(qū),目前放射治療是鼻咽癌主要治療手段。由于鼻咽癌發(fā)病部位隱蔽,臨床癥狀不明顯,診斷時往往分期已經(jīng)較晚,給后期的治療帶來困難。即使經(jīng)過有效治療,仍然有10-15%左右的患者出現(xiàn)復發(fā),復發(fā)后的再程放療,患者的治療及預后效果均不佳�，F(xiàn)鼻咽癌復發(fā)的發(fā)病機制尚未明了,目前大多數(shù)研究認為鼻咽癌的放射抗拒是鼻咽癌復發(fā)的主要原因之一,同時,目前臨床上仍沒有可用于監(jiān)測、診斷、治療鼻咽癌復發(fā)相關的腫瘤標志物,本研究通過蛋白質組學技術篩選出鼻咽癌復發(fā)相關標志物,構建鼻咽癌復發(fā)相關蛋白質表達譜,為臨床上鼻咽癌復發(fā)診療做出貢獻。方法1.采集鼻咽癌復發(fā)和正常復查隨訪組患者的血清進行研究,所有患者嚴格按照入組標準入組。所有患者均為經(jīng)過放射治療后6個月,診斷為鼻咽癌復發(fā)或鼻咽癌正常復查隨訪病人,診斷明確后均在未予任何治療的情況下進行采血,采血后靜置離心,收集血清,分裝進入-80度冰箱進行保存。復發(fā)患者隨機抽取20個標本隨機分入驗證A、B兩組(每組10人),正常復查隨訪患者隨機抽取20個隨機分入驗證A、B兩組(每組10人),復發(fā)組和正常復查隨訪組進行兩兩比較形成A、B兩組,經(jīng)提取蛋白和胰酶消化后,進行TMT標記后,聯(lián)合多維固相/液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)檢測,進行搜庫和Mascot search engine(v.2.3.0)軟件分析,得到復發(fā)與正常復查隨訪間血清差異表達蛋白,并對質譜結果進行質控,同時對兩次實驗進行重復性分析。對差異蛋白進行生物信息學分析。結果1.血清中共鑒定出635個蛋白,其中可定量蛋白為413個,設≥1.2倍,≤0.83倍為差異倍數(shù)。兩次實驗中,在復發(fā)組均表現(xiàn)下調的為41個,均表現(xiàn)為上調的18個。并對2次獨立實驗結果的重復性進行檢驗,用散點圖和皮爾森相關系數(shù)(Pearson's Correlation Coefficient)進行分析。結果表明2次實驗在統(tǒng)計學上一致。同時對酶解的肽段進行質控,肽段的質量及其分布符合質量要求。1.2對差異蛋白進行基于GO的二級注釋分類,1.2.1上調蛋白主要參與單一結構過程(26個蛋白),細胞生理過程(25個蛋白),應激反應(20個蛋白),生物調節(jié)(19個蛋白),定位作用(14個蛋白),代謝過程(13個),信號傳遞(12個),多細胞多組織的生物學過程(12個)等等。細胞構成二級分類中,有23個分子位于胞內(nèi)區(qū),21個位于細胞器內(nèi),13個位于大分子化合物,11個位細胞膜內(nèi),10個分布在胞外區(qū)等。在分子功能分類中發(fā)揮與蛋白質結合功能,參與分子有15個。催化活性的激活有11個分子參與,有6個分子參與了分子結構激活,有3個參與了酶調節(jié)的激活,有1個參與電子活性的激活等。1.2.2下調蛋白中,生物學過程分類顯示:主要參與單一結構反應過程(40個蛋白),生理調節(jié)過程(39個蛋白)細胞生理過程(27個蛋白),應激反應(35個蛋白),生物調節(jié)(19個蛋白),定位作用(13個蛋白),代謝過程(29個),信號傳遞(12個),免疫反應過程(17個),發(fā)育過程(12個),多細胞多組織的生物學過程(11個),多結構反應過程(8個)等等。細胞構成分類中,有23個蛋白位于胞內(nèi)區(qū),20個位于細胞器內(nèi),13個屬于大分子化合物構成,20個位細胞膜內(nèi),37個分布在胞外區(qū),34在細胞內(nèi)等。分子功能分類中,上調蛋白主要發(fā)揮與蛋白質結合功能,參與蛋白有36個。催化活性的激活有9個蛋白參與,有6個參與了酶調節(jié)的激活,有5個參與運輸活性,有3個參與抗氧化作用,有3個參與分子結構活性作用等。1.3基于GO富集分析1.3.1上調蛋白中,進行生物學過程富集度分析表明,差異蛋白主要集中在負向調節(jié)運輸活性,調節(jié)細胞周期,細胞支架的組成,調節(jié)細胞周期的進程,負向調節(jié)分子功能,細胞吞噬作用。細胞構成主要富集在內(nèi)肌質網(wǎng)腔,基質,粘著斑,細胞基質粘連等。分子功能主要富集在與脂蛋白顆粒結合,低密度脂蛋白顆粒結合,未折疊蛋白的結合,膽固醇的結合功能等。1.3.2下調蛋白中,富集度分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白主要參與自我保護反應,補體激活經(jīng)典途徑,免疫球蛋白調節(jié)免疫反應,淋巴調節(jié)免疫力,適應性免疫反應,對壓力的應急反應,激活免疫反應等生物學過程;而在細胞構成的富集度分析中,差異蛋白主要為核小體,染色質、運輸質子的ATP兩部分酶,運輸質子的ATP兩部分酶化合物等;在分子功能的富集度分析中,主要參與抗原結合,運輸質子的ATP合成酶,激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶抑制劑,MHC經(jīng)典途徑蛋白結合。1.4 KEGG信號通路富集分析兩次實驗中均出現(xiàn)hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human),hsa04970 Salivary secretion-Homo sapiens(human),hsa05144 Malaria-Homo sapiens(human)3條通路。在KEGG數(shù)據(jù)庫,hsa05034 Alcoholism-Homo sapiens(human)豐度值最高、參與的基因數(shù)最多,最具有生物學意義。參與基因分別是CALM,H2B,H3,H4,其中基因CALM在細胞增殖、凋亡、自噬、腫瘤干細胞、DNA損傷、細胞運動、抗凋亡等作用相關。1.5結構域的富集度分析對差異蛋白的結構域進行富集度分析,發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要為鈣調蛋白同源結構域、小能量結合蛋白結構域等。1.6聚類分析對差異蛋白進行聚類分析發(fā)現(xiàn),在第1聚類中共有19個蛋白(A2M,ACTN4,ALB,ALDOA,APP,CFD,F13A1,FN1,HRG,KNG1,PF4,PLG,PPBP,SERPINA1,SERPINE1,SERPING1,TIMP1,VWF)參與,其中,上調蛋白只有APP、SERPINE。下調蛋白包括A2M,ALB,F13A1,KNG1,SERPINA1,SERPING1。第二聚類中,包含APCS,APOA1,APOA4,CST3,F2,FGA,GSN,LTF,SERPINC1,TTR,其中,上調蛋白有APCS,FGA,SERPINC1。下調蛋白包括CST3,GSN。第三聚類中,包含APOA2,APOB,APOC3,APOE,LCAT,LPL,其中上調蛋白包含APOA2,沒有下調蛋白。1.7蛋白質網(wǎng)絡互作分析篩選出的所有蛋白進行網(wǎng)絡互作分析,根據(jù)STRING網(wǎng)站進行結果分析,從差異蛋白相互作用的網(wǎng)絡圖和網(wǎng)絡連接度看,網(wǎng)絡圖中連接程度較高的差異蛋白分別為ALB(degree=42)、APP(degree=34)、KNG1(degree=27)、F13A1(degree=25)、SERPING1(degree=25)、A2M(degree=24)、SERPINA1(degree=22)。FGA(degree=19)、SERPINC1(degree=16)、APCS(degree=10)、GSN(degree=10)、APOA2(degree=9)。結論1.本研究通過TMT聯(lián)合質譜分析并篩選出鼻咽癌復發(fā)相關表達蛋白,初步構建了鼻咽癌復發(fā)相關差異蛋白表達譜;2.基于質譜結果,我們進行生物信息學分析挖掘鼻咽癌復發(fā)的可能機制,其中,我們認為CALM、A2M、APP、ALB、F13A1、KNG1、SERPINA1、SERPINE1等是鼻咽癌復發(fā)潛在的相關標志物,補體系統(tǒng)及CALM相關因素可能是鼻咽癌復發(fā)相關的機制之一。第二部分基于ELISA的血清差異蛋白表達驗證背景及目的目前在蛋白質組學的實驗中,質譜得出的結果往往需要進行后期的驗證進一步證明質譜結果的可靠性,我們重新收集血清標本進行ELISA驗證,同時探討該蛋白在鼻咽癌復發(fā)中的可能機制。方法采集復發(fā)組50例和正常隨訪患者50例,進行后期ELISA的血清差異蛋白驗證。我們選擇CALM、A2M、APP三個蛋白進行驗證。運用統(tǒng)計學軟件SPSS21.0和Prism5.0進行統(tǒng)計分析。P值0.05認為有統(tǒng)計學意義。結果1.CALM蛋白結果:由于CALM濃度不符合正態(tài)分布,我們選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進行描述,復發(fā)組和正常復查隨訪組CALM濃度中位數(shù)分別為114.2ng/l和45.10ng/l;第25%位數(shù)的濃度分別為56.08ng/l和23.08ng/l;第75%位數(shù)的濃度分別為240.1ng/l和181.8ng/l;認為兩組之間CALM表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0233),復發(fā)組表達量高于正常復查隨訪組。ROC曲線下面積為0.6931,CALM最佳界值點為48.45ng/l,靈敏度為82.8%,特異度為55%。2.APP蛋白結果:由于APP濃度不符合正態(tài)分布,我們選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進行描述,復發(fā)組和正常復查隨訪組APP濃度中位數(shù)分別為20.08ng/ml和5.502ng/ml,第25%位數(shù)的濃度分別為4.561ng/ml和4.508ng/ml。第75%位數(shù)的濃度分別為28.90ng/ml和10.26ng/ml,認為兩組之間APP表達有統(tǒng)計學差異(P=0.044),復發(fā)組表達量高于正常復查隨訪組。ROC曲線下面積為0.666,APP最佳界值點為16.95ng/ml,靈敏度為55.2%,特異度為90.9%。3.A2M蛋白結果:由于A2M濃度不符合正態(tài)分布,我們選取中位數(shù)及四分位法對蛋白濃度進行描述,復發(fā)組和正常復查隨訪組A2M濃度中位數(shù)分別為34.79ng/ml和75.67ng/ml,第25%位數(shù)的濃度分別為13.27ng/ml和40.03ng/ml;第75%的濃度分別為61.86ng/ml和151.92ng/ml,認為兩組之間A2M表達差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.177,P=0.001),不復發(fā)組表達量高于復發(fā)組。ROC曲線下面積為0.757,A2M最佳界值點為35.21ng/ml,靈敏度為56.5%,特異度為86.7%。結論經(jīng)過ELISA驗證,CALM、A2M、APP三個蛋白的表達趨勢與質譜結果一致,這三者可能是鼻咽癌復發(fā)相關的腫瘤標志物。



本文編號：1431070