發(fā)布時間：2020-11-15 15:29

　　 目的:本文旨在通過細胞分子生物學技術(shù)研究人牙囊干細胞(human dental follicle stem cells,hDFSCs)外泌體對hDFSCs增殖分化的作用,低強度脈沖超聲(Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)作為誘導因素對外泌體特性的影響及可能的調(diào)控機制。方法:1.收集10-14歲患者多生埋伏牙的牙囊組織,組織塊聯(lián)合酶消化法提取hDFSCs原代細胞,使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)及形態(tài),茜素紅和油紅O染色鑒定其成骨和成脂分化能力,流式細胞術(shù)鑒定表面抗原。2.LIPUS輻照處理hDFSCs為實驗組,未做LIPUS處理的hDFSCs為對照組。超速離心法提取兩種處理條件下hDFSCs分泌的外泌體(con-Exo和LIPUS-Exo);通過蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體表面標記蛋白;透射電鏡觀察外泌體形態(tài)特征;納米顆粒跟蹤分析技術(shù)分析外泌體粒子濃度和直徑分布;PKH26對兩種外泌體進行體外熒光標記,與hDFSCs進行共培養(yǎng),激光共聚焦顯微鏡觀察外泌體能否被內(nèi)吞。3.功能學實驗分為3個組:(1)control;(2)con-Exo;(3)LIPUS-Exo。CCK8試驗檢測con-Exo和LIPUS-Exo對hDFSCs增殖活性的影響。成骨誘導7天后,分別對3個組的hDFSCs進行堿性磷酸酶(ALP)染色,并檢測其堿性磷酸酶(ALP)活性,通過PT-PCR檢測ALP、Runx2、Col-1基因的表達;成骨誘導21天后,分別對3個組hDFSCs形成的鈣結(jié)節(jié)進行茜素紅染色。4.作用機制研究:成骨分化實驗分為6個組:(1)control-0μM GW4869;(2)control-10μM GW4869;(3)control-20μM GW4869;(4)LIPUS-0μM GW4869;(5)LIPUS-10μM GW4869;(6)LIPUS-20μM GW4869。用不同濃度(0μM,10μM,20μM)中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869處理hDFSCs,第4-6組每天LIPUS輻照處理細胞,1-3組作為對照。成骨誘導7天后,通過ALP染色和RT-PCR檢測hDFSCs成骨分化能力。炎癥抑制實驗分為5個組:(1)control;(2)LPS;(3)LIPUS;(4)LIPUS+LPS;(5)LIPUS+LPS+GW4869。使用20μM GW4869抑制外泌體分泌,加入LPS刺激炎癥因子分泌,LIPUS處理細胞后通過RT-PCR檢測炎癥因子的表達。促分泌實驗分為2個組:(1)GW4869;(2)GW4869+LIPUS。使用20μM GW4869抑制hDFSCs分泌外泌體后,第2組采用LIPUS儀處理細胞30min,第1組作為對照。通過WB檢測外泌體分泌相關(guān)蛋白的的表達。結(jié)果:1.原代及傳代后的hDFSCs呈不規(guī)則長梭形,可以在誘導培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出成脂和成骨分化的能力。流式細胞術(shù)結(jié)果表明hDFSCs可陽性表達CD90、CD105和CD146,陰性表達CD31和CD45。所以hDFSCs是具備多向分化潛能的間充質(zhì)來源干細胞。2.超速離心法提取未經(jīng)LIPUS處理和LIPUS處理后hDFSCs分泌的外泌體(con-Exo和LIPUS-Exo),蛋白質(zhì)印跡法證實外泌體表面標記蛋白CD9、CD63、TSG101為陽性,Calnexin為陰性;LIPUS-Exo蛋白表達量高于con-Exo;透射電鏡下觀察到兩種外泌體呈雙層膜碟狀結(jié)構(gòu);納米顆粒跟蹤分析技術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)con-Exo和LIPUS-Exo平均粒徑符合外泌體粒徑范圍,相同細胞量提取的外泌體中LIPUS-Exo濃度大于con-Exo濃度;激光共聚焦顯微鏡下觀察到經(jīng)PKH26熒光標記的外泌體在與hDFSCs共培養(yǎng)以后,可以經(jīng)細胞膜內(nèi)吞進入細胞,并分布于細胞質(zhì)。3.CCK8試驗證明,con-Exo和LIPUS-Exo處理均可使hDFSCs增殖活性增強。成骨誘導7天后,外泌體處理組的ALP染色明顯深于對照組。同時,外泌體處理可顯著增強hDFSCs的ALP活性,并促進成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、Col-1的表達。成骨誘導21天后,外泌體處理組的鈣結(jié)節(jié)形成能力明顯強于對照組。LIPUS-Exo促進hDFSCs增殖和成骨分化的作用強于con-Exo。4.在成骨誘導培養(yǎng)的條件下使用不同濃度(0μM,10μM,20μM)的GW4869處理hDFSCs,7天后進行ALP染色,細胞染色深度呈濃度依賴性降低;成骨誘導期間進行了LIPUS輻照處理的hDFSCs染色深度強于未作LIPUS處理的細胞。RT-PCR檢測結(jié)果顯示,在成骨誘導培養(yǎng)的條件下,使用不同濃度的GW4869處理細胞后,成骨相關(guān)基因表達量呈濃度依賴性降低;LIPUS處理可使相應組成骨相關(guān)基因表達量升高。LPS刺激引起了hDFSCs炎癥因子IL-8的表達;使用GW4869抑制hDFSCs外泌體分泌后,IL-8表達量進一步升高;增加誘導因素LIPUS可使hDFSCs的IL-8表達量降低。WB結(jié)果顯示,經(jīng)GW4869處理后,hDFSCs外泌體分泌相關(guān)蛋白表達量較低,而進行LIPUS輻照處理后,外泌體分泌相關(guān)蛋白表達量升高。結(jié)論:本實驗證明LIPUS誘導的hDFSCs來源外泌體可以通過內(nèi)吞作用進入hDFSCs內(nèi),促進hDFSCs的增殖和成骨分化。實驗結(jié)果顯示LIPUS對hDFSCs成骨分化的促進作用可能部分歸因于其增加了hDFSCs外泌體分泌相關(guān)蛋白的表達來促進hDFSCs外泌體分泌,以及抑制了炎癥反應。hDFSCs來源廣泛,具有牙周組織分化潛能,且hDFSCs外泌體容易儲存和移植,具有較低的免疫原性,可以為牙周再生提供新思路。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R781.05
【部分圖文】：

1hDFSCs的原代和傳代培養(yǎng)（40×）

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文18Figure1-2.1TheprimarycultureandsubcultureofhDFSCs（40×）A:原代hDFSCs從組織周圍開始成長，逐漸長滿整個培養(yǎng)瓶B:第3代hDFSCs，細胞呈長梭形結(jié)構(gòu)2.2人牙囊干細胞（hDFSCs）多向分化能力鑒定在成骨誘導21天后，hDFSCs呈緊密、多層重疊的立體結(jié)構(gòu)，并且肉眼可見礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色后，鏡下觀察可見細胞間有紅色的礦化結(jié)節(jié)（圖1-2.2A）。在成脂誘導23天后，hDFSCs形態(tài)變?yōu)槎嘟切危�鏡下可見白色脂滴。油紅O染色后，鏡下觀察可見橙紅色脂滴（圖1-2.2B）。圖1-2.2hDFSCs的多向分化能鑒定（40×）Figure1-2.2ThedetectionofmultipotentialdifferentiationabilityofhDFSCs（40×）A:成骨誘導后茜素紅染可見紅鈣結(jié)節(jié)B:成脂誘導后油紅O染可見橘紅脂滴2.3人牙囊干細胞（hDFSCs）分子表型鑒定流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示hDFSCs分子表型為：間充質(zhì)干細胞特異性表面抗原表達：CD90：99.59%（圖1-2.3C）；CD105：76.56%（圖1-2.3D）；CD146：59.50%（圖1-2.3E）；造血系細胞表面抗原表達：CD31：0.33%（圖1-2.3A）；CD45：0.70%（圖1-2.3B）。此結(jié)果表明，hDFSCs為間充質(zhì)來源，且有干細胞特性。

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文19圖1-2.3hDFSCs的分表型的流式細胞術(shù)鑒定Figure1-2.3ThemolecularphenotypeidentificationofhDFSCsbyflowcytometryA:CD31分表型B:CD45分表型C:CD90分表型D:CD105分表型E:CD146分表型3討論牙囊是與牙齒萌出和發(fā)育相關(guān)的、圍繞在牙胚周圍的疏松結(jié)締組織。有學者研究發(fā)現(xiàn)，圍繞在下頜前磨牙牙胚的牙囊在牙齒的萌出過程中起關(guān)鍵作用，如果沒有牙囊的存在，牙齒就無法萌出[37]。已有研究成功分離出人牙囊細胞，且該細胞呈紡錘形結(jié)構(gòu)，旋渦狀排列，細胞質(zhì)清亮，可貼壁生長，具有成纖維細胞特性[38]。hDFSCs具有較高的增殖能力，熱壓環(huán)境可以增強其增殖能力[39]。此外,hDFSCs具有干細胞特性，在一定條件下可以向成骨、成脂和軟骨細胞分化[40]。與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，hDFSCs的CD146表達量較高。CD146是間充質(zhì)干細胞早期標志物，因此hDFSCs具有較強的克隆形成能力和多向分化能力[41]。牙囊細胞常作為種子細胞或輔助其他種子細胞進行牙周再生。有學者利用細胞膜片技術(shù)延長了細胞的存活時間，使其在相對長的時間內(nèi)持續(xù)釋放生長因子和細胞因子，進而促進牙周再生[34]。也有研究者將牙囊細胞與健康成人和牙周炎患者的牙周膜干細胞（hPDLSCs）共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)牙囊細胞可使兩種hPDLSCs的多向分化能力及自我更新能力增強[42]。
【參考文獻】

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本文編號：2884918