目的本研究以生地炭“制炭存性”差異為切入點,提出“地黃炭止血‘存性’的物質基礎,不僅包括體外轉化物,還包括體內代謝物;而這些物質基礎的量變與質變一定程度上主要取決于制炭工藝”的工作假說。通過采用代謝組學技術,結合熱分析技術,對生地黃(炒炭、煅炭)的工藝參數進行量化表征;對生地炭在體內動態(tài)變化過程和代謝產物變化進行比較分析,進而闡明生地黃制炭(炒炭、煅炭)工藝與其止血“存性”之間的相關性,構建基于熱分析-代謝組學技術的中藥炮制工藝與炮制機制研究的新模式。方法1.建立生地黃及其兩種制炭品(炒炭、煅炭)10批樣品HPLC指紋圖譜。色譜條件:采用Hypersil GOLD aq C_(18)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流動相乙腈-0.1%磷酸水,梯度洗脫,體積流量為1 mL·min~(-1),柱溫為30℃,檢測波長210nm。對結果進行主成分分析、聚類分析和相似度評價。2.生地黃制炭前后血中有效成分群的初步確定:分別制備生地黃及其制炭品的水提物樣品,將各提取物給大鼠連續(xù)灌胃3天,取血,制備大鼠含藥血清。采用HPLC指紋圖譜方法對大鼠的含藥血清進行檢測,確定血中移行成分。結合生地黃制炭前后體外化學成分組研究結果,綜合分析,初步確定生地炭可能的藥效物質基礎。3.采用熱重分析技術,以生地黃為試樣,在程序升溫條件下,通過變換熱分析氣氛,即分別以空氣、氮氣氣氛,模擬傳統(tǒng)制炭品制備過程;同時,在相同實驗條件下,以地黃藥效物質群進行熱重分析實驗;最終,以藥效物質群最大熱失重速率所對應的溫度作為生地黃制炭工藝參數(火力、火候)量化指標。4.通過皮下注射20%干酵母聯(lián)合無水乙醇灌胃的方法建立血熱出血模型,基于超高效液相色譜-質譜聯(lián)用(UPLC-MS)代謝組學技術平臺,通過對血清中小分子代謝產物的系統(tǒng)分析,尋找兩種制炭方式(炒炭、煅炭)的差異代謝物和代謝途徑。結果1.10批生地黃樣品共指認出15個色譜峰,炒炭品共指認出11個色譜峰,煅炭品共指認出8個色譜峰。且生地黃和兩種制炭品在主成分分析和聚類分析中均能達到顯著分離,相似度評價揭示了產地對樣品的差異化影響。2.性別對地黃及其制炭品入血藥效成分沒有顯著影響。生地黃兩種制炭法(炒炭和煅炭)之間入血成分類似,但是具體含量有差別,究竟由制炭方式引起還是由其他因素導致的仍然需要進一步考察。另外生地黃制炭前后,研究認為梓醇以原形進入到血液中,是地黃的生物藥效指標。3.地黃炒炭的最佳溫度應控制在果糖、梓醇熱解之前,為5-HMF熱解最大熱失重速率峰時的溫度,即216.3℃為地黃炒炭最佳溫度,梓醇的最大熱失重速率峰峰溫274.3℃為炒炭溫度上限。4.生地黃煅炭的最佳溫度應控制在果糖、梓醇熱解之前,為5-HMF熱解最大熱失重速率峰時的溫度,即194.2℃為地黃煅炭最佳溫度,梓醇的最大熱失重速率峰峰溫276.8℃為煅炭溫度上限。5.基于血熱出血模型和UPLC-MS代謝組學技術平臺的生地黃不同制炭方式(炒炭、煅炭)的差異代謝物和代謝途徑研究。(1)通過皮下注射20%干酵母聯(lián)合無水乙醇灌胃的方法建立血熱出血模型。模型大鼠肺、胃組織肉眼可見多個出血點,肝腎顏色加深,肺組織病理檢查表現為間質出血、炎性細胞浸潤,肛溫在8h內顯著升高(P0.05),TT和PT顯著延長(P0.05),血漿FIB含量顯著增加(P0.05),說明血熱出血模型大鼠凝血功能異常,有明顯的出血傾向。此外,陽性藥組、生地黃組、炒炭組(傳統(tǒng)和新法)、煅炭組(傳統(tǒng)和新法)均可顯著的降低不同凝血因子的相對含量(P0.05),表明生地黃制炭(炒炭、煅炭)后止血作用增強,止血作用在生地黃炒炭品和煅炭品之間具備一定的差異性。本研究結果也表明生地黃、生地黃炒炭品和生地黃煅炭品通過增強機體內源性凝血系統(tǒng)的功能發(fā)揮止血作用。(2)模型大鼠不僅存在凝血功能異常,還呈現血液流變學異常。具體表現為全血高中低切黏度、血漿黏度、全血高、低切還原黏度,紅細胞剛性指數,紅細胞聚集指數等均顯著升高(P0.05)。分析認為,生地黃炒炭品可顯著改善相關血液流變學指標(P0.05),表明生地黃炒炭后依然保留其“涼血”作用。而生地黃煅炭品僅在全血高切和低切還原粘度有顯著的降低作用(P0.05),對其他血液流變學指標未有顯著影響。其余各組的上述相關指數在一定程度上也得到改善。(3)不同火力、火候的炮制方式對其炮制品的藥效具備顯著差異性影響(P0.05)。新法炒炭、煅炭品與傳統(tǒng)制法從止血涼血的藥效研究來看仍然具備一定差異,但是其仍保留了地黃炭涼血止血的療效。另一方面炮制太過和炮制不及的地黃制炭品在涼血止血方面療效不顯著,進一步印證了中藥傳統(tǒng)炮制理論有關“凡藥制造,貴在適中,不及則功效難求,太過則氣味反失”的論述。(4)通過基于血熱出血模型大鼠血清代謝組學的研究,表明不同炮制方式對炮制品內源性代謝輪廓具備顯著的影響,具體表現為:1)生地黃炒炭和煅炭的炮制方式具備一定的差異性。2)新法炒、煅炭和傳統(tǒng)炒、煅炭炮制品之間具備差異性。3)炮制太過和炮制不及對其內源性產物之間具備差異性。但是,綜合分析認為,無論何種炮制方式,仍然有向空白組回調的趨勢,表明地黃制炭后均有不同程度“存性”。(5)基于非靶標代謝組學平臺,篩選了傳統(tǒng)炒炭和傳統(tǒng)煅炭兩種炮制方式之間的42個差異性代謝產物,進一步分析了其可能參與的17條代謝通路、內源性小分子在各組之間的含量差異和其調節(jié)趨勢,探究了其發(fā)揮療效的生物學機制。結論本研究通過指紋圖譜和血清藥物分析鑒定了生地黃兩種制炭方式(炒炭、煅炭)的體外藥效學物質。采用代謝組學技術,結合熱分析技術,對生地黃(炒炭、煅炭)的工藝參數進行了量化表征;同時對生地炭在體內動態(tài)變化過程和代謝產物變化進行比較分析,認為生地黃炒炭品具有“涼血止血”作用,生地黃煅炭品僅保留“止血”作用,而無顯著的“涼血”作用。中藥炮制過程中火力、火候對炮制品的藥效物質和代謝輪廓影響顯著。同時篩選得到生地黃制炭(炒炭、煅炭)的42個差異性代謝產物,進一步分析了其可能參與的17條代謝通路和內源性小分子在各組之間的含量差異、調節(jié)趨勢,闡明了生地黃制炭(炒炭、煅炭)工藝與其止血“存性”之間的相關性。
【學位單位】：山西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R283
【部分圖文】：
生地黃炭止血“存性”與制炭工藝相關性研究9項色譜條件下，記錄高效液相色譜圖，通過相似度評價軟件計算相似度，結果相似度大于0.97，表明該方法重復性良好。2.4指紋圖譜建立分別取10批生地黃和生地黃炒炭、生地黃煅炭樣品，按“2.2”制備方法炮制并且按照“2.1”方法測定，記錄高效液相色譜圖，運用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2008A版”對所得指紋圖譜進行分析，結果見圖2-6和表2。圖2混合對照品HPLC色譜圖注：1.梓醇；2.5-HMF；3.地黃苷D；4.益母草苷；5.毛蕊花糖苷圖310批不同產地生地黃指紋圖譜
生地黃炭止血“存性”與制炭工藝相關性研究9項色譜條件下，記錄高效液相色譜圖，通過相似度評價軟件計算相似度，結果相似度大于0.97，表明該方法重復性良好。2.4指紋圖譜建立分別取10批生地黃和生地黃炒炭、生地黃煅炭樣品，按“2.2”制備方法炮制并且按照“2.1”方法測定，記錄高效液相色譜圖，運用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2008A版”對所得指紋圖譜進行分析，結果見圖2-6和表2。圖2混合對照品HPLC色譜圖注：1.梓醇；2.5-HMF；3.地黃苷D；4.益母草苷；5.毛蕊花糖苷圖310批不同產地生地黃指紋圖譜
10批不同產地生地黃炒炭指紋圖譜
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本文編號：
2888060
