發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 16:52

　　 目的:克隆和表達(dá)弓形蟲截短型主要表面抗原1(tSAG1),建立診斷弓形蟲病的納米金生物傳感器。方法:以弓形蟲基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增SAG1編碼區(qū)515位至1267位的核酸序列,克隆至pMD18-T載體,測(cè)序鑒定,亞克隆至表達(dá)載體pET-28a(+),誘導(dǎo)表達(dá)tSAG1,金屬螯合層析純化,Western blot分析其免疫活性。種子生長(zhǎng)法制備金納米棒(Au NRs),偶聯(lián)tSAG1,構(gòu)建tSAG1-Au NRs生物傳感器檢測(cè)人血清抗弓形蟲SAG1抗體;采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析測(cè)定值,按大于或等于體檢健康者血清紅移值的x+2SD判定為陽性,計(jì)算敏感度、特異度、預(yù)測(cè)值和診斷效率。谷胱甘肽法制備金納米簇,經(jīng)活化后,與羊抗人IgG連接;將tSAG1包被在微孔板孔內(nèi),與人血清弓形蟲抗體結(jié)合,再與金納米簇-羊抗人IgG作用,加入檸檬酸三鈉溶液及嗎啉乙磺酸-水合物溶液稀釋的過氧化氫反應(yīng)30min,再加入氯金酸溶液反應(yīng)1h,肉眼觀察結(jié)果,并測(cè)定550nm處的吸光度值OD_(550);采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析測(cè)定值,按小于或等于體檢健康者血清OD_(550)的x-2SD判定為陽性,計(jì)算敏感度、特異度、預(yù)測(cè)值和診斷效率。結(jié)果:構(gòu)建了tSAG1的表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)純化獲得有免疫反應(yīng)性的tSAG1,分子質(zhì)量為約30kDa。tSAG1-Au NRs生物傳感器的檢驗(yàn)敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和診斷效率依次為80.9%、90.0%、90.2%、80.6%和85.2%�；�于金納米簇模擬酶性質(zhì)構(gòu)建的可視化生物傳感器的檢測(cè)敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和診斷效率依次為80.0%、90.0%、88.9%、81.8%和85.0%。結(jié)論:基于重組tSAG1建立的納米金生物傳感器可用于檢測(cè)弓形蟲抗體。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;R531.8
【部分圖文】：

弓形蟲重組蛋白SAG1納米金生物傳感器診斷弓形蟲病的研究3.結(jié) 果的基因 tSAG1 的克隆與鑒定CR 擴(kuò)增 tSAG1 基因的電泳圖譜如圖 1。PCR 獲得了約為 760bp 的 tSAG克隆的 pMD18-T-tSAG1 的陽性菌落的 PCR 獲得了約為 760bp 的片段（如測(cè)序結(jié)果與 GenBank 報(bào)道的 SAG1 進(jìn)行 BLAST 比對(duì)（如圖 3），在 77由 T 突變?yōu)?C，為錯(cuò)義突變，編碼的氨基酸由 Ser 突變?yōu)?Pro。經(jīng) DNAstn 分析，其抗原表位未發(fā)生改變。

12圖 3-3 pMD18-T-tSAG1 測(cè)序結(jié)果與 RH 株 JX045421.1 的 SAG1 基因序列對(duì)比重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+)-tSAG1 的構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切（BamH I 和 Sal I）和菌落 PCR 圖譜如圖 4。由酶切和 PCR 均獲得約為 760bp 的片段，與 SAG1 理論長(zhǎng)度一致。

圖 3-4 重組 pET-tSAG1 的鑒定標(biāo)準(zhǔn)；1: pET-tSAG1 質(zhì)粒；2: pET-tSAG達(dá)、純化與鑒定 pET-tSAG1 的菌株經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)前株未見 tSAG1 大量表達(dá)，誘導(dǎo)后于包涵體中。表達(dá)的 tSAG1 的大小見圖 6。純化獲得 tSAG1 的大小清抗體特異識(shí)別，提示具有良好的
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