發(fā)布時(shí)間：2025-06-28 02:47

　　喹賽多是新型喹噁啉類廣譜抗菌促生長的動(dòng)物專用藥,其化學(xué)結(jié)構(gòu)保留了喹噁啉-1,4-二氧化物母環(huán),同時(shí)在其基礎(chǔ)上對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行改造,以降低毒性的同時(shí)保留其抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)已從基礎(chǔ)毒理、抗菌活性、基礎(chǔ)代謝和抗菌促生長機(jī)理等各方面對(duì)喹賽多進(jìn)行深入研究,以求證實(shí)其安全無毒,抗菌促生長的同時(shí)闡明其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。2007年,朱慧玲研究了喹賽多對(duì)豬體內(nèi)內(nèi)分泌的影響,發(fā)現(xiàn)喹賽多可以在整體水平調(diào)節(jié)體內(nèi)多種重要內(nèi)分泌因子的表達(dá),其中最值得關(guān)注的為生長激素(GH)的上調(diào)表達(dá),然而其作用機(jī)制尚不清楚。為了闡明喹賽多影響GH合成和分泌的分子機(jī)制,本課題以大鼠垂體腺瘤細(xì)胞(GH3細(xì)胞)暴露于喹賽多為實(shí)驗(yàn)材料,運(yùn)用Afrymetrix公司的GeneChip? Rat Gene1.0ST Array芯片和雙向電泳—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),查找喹賽多作用于GH3細(xì)胞后差異表達(dá)的基因和蛋白,以求更加全面的了解喹賽多作用后GH3細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化。進(jìn)而通過Gene Ontology, KEGG等進(jìn)行功能富集分析,找到發(fā)揮作用的功能基因組和蛋白質(zhì)組,綜合分析基因組和蛋白組的結(jié)果,進(jìn)而闡明喹賽多影響GH合成和分泌的分子機(jī)理。 1.基...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 喹賽多的研究進(jìn)展
    1.2 GH轉(zhuǎn)錄,合成和分泌的研究進(jìn)展
    1.3 本課題研究技術(shù)
    1.4 研究內(nèi)容和目標(biāo)
2 材料方法
    2.1 細(xì)胞株
    2.2 主要試劑
    2.3 主要儀器
    2.4 主要試劑的配制
    2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及凍存
    2.6 細(xì)胞總RNA的提取
        2.6.1 細(xì)胞處理
        2.6.2 RNA的提取
        2.6.3 RNA濃度測定及質(zhì)量檢測
    2.7 cDNA的合成
    2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測GHmRNA表達(dá)水平的變化
        2.8.1 引物設(shè)計(jì)
        2.8.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系
        2.8.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析
        2.8.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.9 ELISA方法檢測GH分泌量的變化
        2.9.1 待測樣品準(zhǔn)備
        2.9.2 GH分泌量測定步驟
        2.9.3 結(jié)果計(jì)算
    2.10 BCA法檢測細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量
    2.11 Western Blot方法檢測GH蛋白表達(dá)情況
        2.11.1 細(xì)胞處理
        2.11.2 細(xì)胞蛋白提取及濃度測定
        2.11.3 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.11.4 轉(zhuǎn)膜
        2.11.5 封閉
        2.11.6 一抗孵育
        2.11.7 二抗孵育
        2.11.8 化學(xué)發(fā)光顯色
    2.12 喹賽多對(duì)GH3細(xì)胞影響的基因表達(dá)譜檢測
        2.12.1 總RNA的提取和純化
        2.12.2 cDNA的合成和純化
        2.12.3 IVT合成cRNA和cRNA的純化
        2.12.4 cRNA片段化
        2.12.5 芯片雜交
        2.12.6 芯片洗脫
        2.12.7 芯片掃描
    2.13 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片中差異基因的mRNA表達(dá)
        2.13.1 引物設(shè)計(jì)
        2.13.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系
        2.13.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析
        2.13.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.14 雙向電泳技術(shù)檢測GH3細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
        2.14.1 細(xì)胞處理及分組
        2.14.2 細(xì)胞總蛋白的制備
        2.14.3 蛋白質(zhì)定量
        2.14.4 蛋白質(zhì)水化上樣
        2.14.5 一相等點(diǎn)聚焦(IEF)
        2.14.6 IPG膠條平衡
        2.14.7 二相SDS-PAGE電泳
        2.14.8 染色
        2.14.9 圖像掃描及分析
    2.15 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定
        2.15.1 膠內(nèi)酶解
        2.15.2 MALDI-TOF質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫搜索
    2.16 Western Blot方法驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)情況
        2.16.1 細(xì)胞處理
        2.16.2 細(xì)胞蛋白提取及濃度測定
        2.16.3 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.16.4 轉(zhuǎn)膜
        2.16.5 封閉
        2.16.6 一抗孵育
        2.16.7 二抗孵育
        2.16.8 化學(xué)發(fā)光顯色
3 結(jié)果
    3.1 GH3細(xì)胞培養(yǎng)
    3.2 RNA濃度的測定及質(zhì)量檢測
        3.2.1 RNA濃度測定
        3.2.2 RNA質(zhì)量的檢測
    3.3 喹賽多作用于GH3細(xì)胞GHmRNA表達(dá)水平的變化
        3.3.1 溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.3.2 喹賽多作用于GH3細(xì)胞GHmRNA表達(dá)水平的變化
        3.3.3 PCR產(chǎn)物的驗(yàn)證
    3.4 ELISA方法檢測喹賽多作用下GH3細(xì)胞中GH分泌量的變化
        3.4.1 ELISA方法檢測GH分泌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.4.2 喹賽多作用于GH3細(xì)胞GH分泌量的變化
    3.5 喹賽多作用于GH3細(xì)胞總蛋白的變化
    3.6 Western blot檢測GH蛋白的表達(dá)水平
    3.7 基因芯片顯示的差異基因分析
    3.8 Real-time PCR驗(yàn)證基因芯片中部分差異基因的mRNA表達(dá)
        3.8.1 相關(guān)基因定量溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.8.2 熒光定量PCR驗(yàn)證基因與芯片結(jié)果對(duì)比情況
    3.9 雙向電泳尋找喹賽多作用GH3細(xì)胞后差異表達(dá)蛋白結(jié)果
        3.9.1 蛋白質(zhì)定量
        3.9.2 喹賽多對(duì)GH3細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        3.9.3 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果
        3.9.4 Western blot驗(yàn)證基因芯片和雙向電泳結(jié)果
4 討論
    4.1 喹賽多對(duì)GH3細(xì)胞作用差異基因的分析
        4.1.1 喹賽多孵育GH3細(xì)胞1h差異表達(dá)的基因
        4.1.2 喹賽多孵育GH3細(xì)胞12h差異表達(dá)的基因
    4.2 差異基因的功能分析
        4.2.1 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因
        4.2.2 調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝相關(guān)基因
        4.2.3 離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因
    4.3 喹賽多對(duì)GH3細(xì)胞作用差異蛋白的分析
    4.4 喹賽多對(duì)GH3細(xì)胞作用差異蛋白功能分析
        4.4.1 分子伴侶
        4.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
        4.4.3 蛋白激酶因子
        4.4.4 維持細(xì)胞形態(tài)相關(guān)蛋白
        4.4.5 物質(zhì)代謝與能量代謝
    4.5 基因芯片及雙向電泳結(jié)果之間的關(guān)系
    4.6 喹賽多影響GH3細(xì)胞GH合成和分泌的分子機(jī)理
5 全文總結(jié)
6 文獻(xiàn)綜述：藥物基因組和蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展
    1 藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展
        1.1 藥物基因組學(xué)發(fā)展簡史
        1.2 藥物基因組概念與基本原理
        1.3 藥物基因組的主要研究方法
            1.3.1 表型和基因型分析
            1.3.2 藥物效應(yīng)圖譜
            1.3.3 連鎖分析及關(guān)聯(lián)分析
            1.3.4 單核苷酸多態(tài)性
            1.3.5 基因芯片技術(shù)
            1.3.6 基因表達(dá)連續(xù)分析
        1.4 藥物基因組的研究現(xiàn)狀
            1.4.1 尋找新藥靶
            1.4.2 加速新藥研發(fā)
            1.4.3 指導(dǎo)臨床合理用藥
        1.5 藥物基因組的發(fā)展前景
    2 藥物蛋白質(zhì)組的研究進(jìn)展
        2.1 藥物蛋白質(zhì)組的發(fā)展簡史
        2.2 藥物蛋白質(zhì)組的概念與基本原理
        2.3 藥物蛋白質(zhì)組的主要研究方法
            2.3.1 雙向電泳與質(zhì)譜聯(lián)用
            2.3.2 液相色譜(LC)分離配合質(zhì)譜(MS)鑒定
            2.3.3 生物質(zhì)譜技術(shù)
            2.3.4 生物傳感芯片質(zhì)譜技術(shù)
            2.3.5 同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)(ICAT)
            2.3.6 蛋白質(zhì)芯片
            2.3.7 酵母雙雜交系統(tǒng)和其他技術(shù)
        2.4 藥物蛋白質(zhì)組的研究現(xiàn)狀
            2.4.1 藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)
            2.4.2 闡明藥物作用機(jī)制
            2.4.3 藥物的篩選和新藥發(fā)現(xiàn)
        2.5 藥物蛋白質(zhì)組的發(fā)展前景
參考文獻(xiàn)
致謝
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附錄



本文編號(hào)：4054300