發(fā)布時(shí)間：2025-07-02 04:52

　　牛病毒性腹瀉/黏膜病是危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列入必須通報(bào)的動(dòng)物傳染病。牛病毒性腹瀉病臨床表現(xiàn)形式復(fù)雜、多樣，使其預(yù)防和控制難度加大。雖然疫苗接種是預(yù)防該病的有效途徑，但國(guó)內(nèi)目前還沒(méi)有商品化的牛病毒性腹瀉疫苗可供使用，所以研發(fā)一種安全、高效的牛病毒性腹瀉疫苗是預(yù)防和控制該病的主要發(fā)展方向。目前，以偽狂犬病毒為載體的新型活載體疫苗已在動(dòng)物疫病的預(yù)防控制中得到了廣泛的研究和應(yīng)用，并顯示出其顯著的優(yōu)越性�；�于此，本研究在對(duì)牛病毒性腹瀉病毒甘肅流行株BVDV/GS01/2010分離鑒定的基礎(chǔ)上，開(kāi)展其E2結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位等的預(yù)測(cè)及其同源性和遺傳進(jìn)化分析，重點(diǎn)構(gòu)建豬偽狂犬病毒gE/TK基因缺失載體，旨在獲得牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的gE-/TK-重組偽狂犬病毒。具體如下： 1.利用MDBK細(xì)胞從疑似患牛病毒性腹瀉病牛的血液中成功分離出一株流行于甘肅省甘南藏族自治州的能致細(xì)胞病變的牛病毒性腹瀉病毒株，將其命名為BVDV/GS01/2010，并用該病毒人工感染健康犢牛，成功復(fù)制出牛病毒性腹瀉病例。同時(shí)應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該分離株病毒的5′-UTR核苷酸序列...

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
英文縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    一、牛病毒性腹瀉-黏膜病毒研究進(jìn)展
        1 BVDV病原學(xué)特性
            1.1 發(fā)現(xiàn)與命名
            1.2 主要特性
        2 BVDV基因組及其特征
        3 BVDV的基因分型
        4 BVDV生物型之間轉(zhuǎn)化的機(jī)制
        5 BVDV的流行概況
        6 BVDV檢測(cè)方法
            6.1 病毒分離
            6.2 RT-PCR技術(shù)
        7 國(guó)內(nèi)BVD防控現(xiàn)狀
        8 國(guó)外BVDV疫苗的研制
            8.1 傳統(tǒng)疫苗
            8.2 新型疫苗
        9 小結(jié)與展望
    二、PRV重組活載體疫苗株的研究進(jìn)展
        1 PRV概述
        2 PRV活載體基因重組疫苗株的構(gòu)建及應(yīng)用
        3 小結(jié)與展望
    三、本研究的目的意義
第二章 BVDV/GS01/2010株的分離、鑒定
    摘要
    1 材料
        1.1 病料來(lái)源
        1.2 細(xì)胞系、菌種及常用試劑
        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 方法
        2.1 病料處理
        2.2 BVDVRNA提取
        2.3 臨床樣品的RT-PCR檢測(cè)
            2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成
            2.3.2 RT-PCR檢測(cè)
        2.4 BVDV5′-UTR核苷酸序列的生物信息學(xué)分析
        2.5 病毒的分離
        2.6 病毒的鑒定
            2.6.1 病毒粒子的電鏡觀察
            2.6.2 TCID50的測(cè)定
            2.6.3 本動(dòng)物回歸試驗(yàn)
    3 結(jié)果
        3.1 臨床樣品的RT-PCR檢測(cè)
        3.2 5′-UTR序列的測(cè)定及其分析
        3.3 病毒分離
        3.4 病毒電鏡觀察
        3.5 TCID50測(cè)定
        3.6 本動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)
    4 討論
第三章 BVDV/GS01/2010流行毒株E2基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    摘要
    1 材料
        1.1 毒株及細(xì)胞
        1.2 主要試劑
    2 方法
        2.1 E2基因的克隆
        2.2 E2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位的預(yù)測(cè)
        2.3 E2基因的遺傳進(jìn)化分析
    3 結(jié)果
        3.1 E2基因的克隆
        3.2 E2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.3 E2蛋白的親水性分析
        3.4 E2蛋白的表面可能性分析
        3.5 E2蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)分析
        3.6 E2基因核苷酸序列同源性比較
        3.7 E2基因推導(dǎo)氨基酸同源性分析
        3.8 E2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
    4 討論
第四章 表達(dá)BVDVE2基因的重組PRV病毒的構(gòu)建
    摘要
    1 材料
        1.1 毒株與細(xì)胞系
        1.2 主要試劑
    2 方法
        2.1 引物設(shè)計(jì)和合成
        2.2 PRVBarthaK61疫苗株的細(xì)胞增殖及其DNA的提取
        2.3 BVDV/GS01/2010株RNA的提取
        2.4 目的基因的獲得
        2.5 pTK-轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.6 pTK-/EGFP通用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.7 pTK-/EGFP/E2轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.8 PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重組病毒的構(gòu)建
            2.8.1 pTK-/EGFP/E2質(zhì)粒的提取
            2.8.2 共轉(zhuǎn)染
            2.8.3 蝕斑篩選
            2.8.4 PCR鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 目的基因的獲得
        3.2 pTK-轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定
        3.3 pTK-/EGFP通用轉(zhuǎn)移載體的鑒定
        3.4 pTK-/EGFP/E2轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定
        3.5 PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重組病毒的篩選
        3.6 PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重組病毒的PCR鑒定
    4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
導(dǎo)師簡(jiǎn)介
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：4055266