發(fā)布時間：2020-11-17 19:38

　　 背景:自噬(autophagy)是一種由營養(yǎng)饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激、自由基氧化應(yīng)激等信號引起的溶酶體介導(dǎo)的降解過程,其在細(xì)胞能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞生存等過程中起至關(guān)重要的調(diào)控作用。自噬過程異常與多種疾病直接相關(guān),研究自噬過程的分子機(jī)理及其調(diào)節(jié)信號通路,可能促進(jìn)發(fā)現(xiàn)疾病治療的新方法和新靶點(diǎn)。早期的研究認(rèn)為自噬對底物沒有選擇性。近年來研究發(fā)現(xiàn)很多自噬過程,如損壞的線粒體、過氧化物體等細(xì)胞器以及變性蛋白聚集物的自噬清除,自噬底物首先經(jīng)過泛素化標(biāo)記,然后由自噬受體(autophagy receptor)識別結(jié)合泛素化的底物并通過自噬體蛋白LC3將自噬底物連接到自噬前體(phagophore),形成自噬體(autophagosomes)后運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解。這一類由自噬受體選擇識別泛素化自噬底物的自噬過程稱為選擇性自噬(selective autophagy)。目前,針對泛素化對自噬過程調(diào)節(jié)的研究主要集中在選擇性自噬底物的調(diào)控上,而對自噬蛋白本身以及選擇性自噬的啟動、活化和自噬體形成的調(diào)控等方面的研究則相對較少。因此,深入研究泛素化對自噬蛋白及自噬受體的調(diào)控作用,對于理解選擇性自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制具有較大的理論意義。NEDD4(又稱NEDD4-1)是屬于HECT家族的泛素連接酶,最初是在小鼠神經(jīng)元前體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的,其在多種腫瘤組織高度表達(dá)。在篩選NEDD4的泛素化底物時發(fā)現(xiàn)NEDD4傾向于泛素化酪氨酸激酶及內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運(yùn)分類蛋白,其通過泛素化不同的底物參與調(diào)控離子通道的活性、膜受體的內(nèi)吞、病毒出芽以及神經(jīng)元發(fā)育等生理過程。目前已有個別研究表明,NEDD4可能在自噬過程中起著重要作用,但其對自噬的調(diào)節(jié)過程及機(jī)制并不清楚。通過序列分析發(fā)現(xiàn),NEDD4含有4個潛在的WXXL/I,提示NEDD4很可能與LC3相互作用并參與自噬特別是選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)。因而進(jìn)一步研究泛素連接酶NEDD4在自噬泛素化調(diào)節(jié)中的作用,對于理解選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)機(jī)理,具有重要的理論意義。研究目的:本文旨在研究泛素連接酶NEDD4與自噬體蛋白LC3及自噬受體SQSTM1之間的關(guān)系,深入探討NEDD4介導(dǎo)的自噬受體SQSTM1泛素化信號在選擇性自噬過程中的作用及其機(jī)制,為選擇性自噬的泛素化調(diào)節(jié)提供新的理論依據(jù),為自噬相關(guān)疾病的臨床治療提供新的方向和思路。研究方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和處理HEK293T,HEK293A,A549,HepG2和BE(2)-C cells均購于ATCC。細(xì)胞以含有1%penicillin/streptomycin和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO_2條件下培養(yǎng)。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求,細(xì)胞給予饑餓或1uM Rapamycin處理18h以激活自噬,或者溶酶體抑制劑Chloroquine(50uM)處理18h。在SQSTM1和NBR1泛素化分析相關(guān)試驗(yàn)中,細(xì)胞使用10uM MG132或10uM Bortezomib預(yù)處理18h以抑制蛋白降解。2.蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western blot)通過Western blot技術(shù)對相應(yīng)蛋白指標(biāo)NEDD4,LC3,SQSTM1,BECN1,PDCD6IP及NBR1在細(xì)胞中進(jìn)行半定量。3.免疫共沉淀(CO-IP)和GST-LC3B pulldown實(shí)驗(yàn)使用CO-IP和GST-LC3B pulldown技術(shù)獲得與NEDD4蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì),通過Western blot檢測NEDD4與相應(yīng)蛋白結(jié)合情況。4.慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)通過PCR以及分子克隆技術(shù)構(gòu)建pLKO.1-shNEDD4和pFUW-HA-NEDD4-q(the shRNA-resistant NEDD4)慢病毒載體用以分別沉默、恢復(fù)表達(dá)NEDD4。過表達(dá)pLVTHM-GFP-LC3和pLVTHM-GFP-SQSTM1用來示蹤自噬。5.透射電子顯微鏡技術(shù)(TEM)采用TEM觀察對照組和NEDD4 shRNA組細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體形成的變化,評價(jià)敲低NEDD4對自噬的影響。6.細(xì)胞免疫熒光利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察細(xì)胞自噬過程、亞細(xì)胞蛋白定位以及膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程。7.Cyto-ID自噬檢測試劑盒染色選用Cyto-ID自噬檢測試劑盒使活細(xì)胞中的自噬體攜帶標(biāo)記,在共聚焦顯微鏡下跟蹤活細(xì)胞中標(biāo)記的自噬體,動態(tài)觀察自噬過程,并定量分析自噬過程。8.泛素化蛋白檢測采用CO-IP結(jié)合Western blot技術(shù)和GST-Uba pulldown結(jié)合Western blot技術(shù)檢測泛素化蛋白。首先用一抗IP再進(jìn)行SDS-PAGE電泳孵育anti-Ub抗體檢測泛素化蛋白,或者先采用GST-Uba親和沉淀再進(jìn)行SDS-PAGE電泳孵育anti-SQSTM1抗體檢測泛素化蛋白。9.離體E3泛素連接酶活性測定在HEK293T細(xì)胞里過表達(dá)NEDD4,通過免疫沉淀分離NEDD4,將免疫沉淀的NEDD4與不同量的純化LC3B蛋白在冰上共同孵育;然后添加單體泛素到反應(yīng)混合物中啟動泛素連接反應(yīng);最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離多聚泛素,通過anti-Ub抗體檢測由單泛素綴合的多聚泛素產(chǎn)物,以評估NEDD4的連接酶活性。研究結(jié)果:1.免疫共沉淀和GST-LC3B pulldown結(jié)果表明NEDD4能與自噬體蛋白LC3相互作用,并鑒定出NEDD4中的LIR2結(jié)構(gòu)域是與LC3結(jié)合的位點(diǎn)。2.NEDD4敲低導(dǎo)致嚴(yán)重的自噬缺陷,引起SQSTM1蛋白累積,并阻斷Rapamycin或饑餓誘導(dǎo)的自噬激活。3.NEDD4敲低誘導(dǎo)LC3陽性自噬前體和自噬體變形和聚集,并且NEDD4敲低誘導(dǎo)聚集的GFP-LC3B斑點(diǎn)與ER膜標(biāo)志物共定位。4.電子顯微鏡觀察到敲低NEDD4導(dǎo)致肺癌A549細(xì)胞中的線粒體變形,提示NEDD4可能在線粒體自噬中發(fā)揮一定作用。5.LC3不是NEDD4的泛素化底物,而是NEDD4的活化蛋白。6.NEDD4通過其HECT結(jié)構(gòu)域直接與自噬受體SQSTM1的PB1結(jié)構(gòu)域相互作用并使其發(fā)生泛素化,NEDD4對SQSTM1的泛素化是在PB1結(jié)構(gòu)域上通過K63位交聯(lián)形成的,此泛素化并不涉及到蛋白酶體介導(dǎo)的降解;而另一自噬受體NBR1既不是NEDD4的結(jié)合蛋白也不是NEDD4的泛素化底物。7.敲低NEDD4或過表達(dá)NEDD4連接酶失活突變體(NEDD4-LD)引起包涵體自噬缺陷,導(dǎo)致異常增大的SQSTM1陽性包涵體聚集,并且與ER標(biāo)記物CANX共定位。研究結(jié)論:自噬體蛋白LC3與NEDD4結(jié)合并激活NEDD4的連接酶活性,可能促進(jìn)NEDD4與自噬受體SQSTM1特異結(jié)合并泛素化SQSTM1,并且該泛素化信號調(diào)控SQSTM1介導(dǎo)的包涵體自噬。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

細(xì)胞自噬類型[21]

圖 1.2 自噬受體蛋白結(jié)構(gòu)[100]Figure 1.2 Domain structures of autophagy receptor proteins.1.5.1 SQSTM1 蛋白p62/SQSTM1（以下簡稱 SQSTM1），是第一個被鑒定出來的自噬受體蛋01]。SQSTM1 是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白[102]，最初被鑒定為 p56lck SH 結(jié)構(gòu)域的磷酸酸非依賴性配體[103]。Shin 首先克隆出 p62，并在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn) p62 具有蛋白聚集體的能力，據(jù)此 Shin 將 p62 命名為 sequestosome 1 (SQSTM1) [104]后，其在小鼠、大鼠以及果蠅中的同源物分別命名為A170、ZIP和Ref(2)P[105-1鼠 A170，與人 SQSTM1 同源，最初在巨噬細(xì)胞中被認(rèn)為是應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞白[108]。目前，SQSTM1 被認(rèn)為是一種多功能蛋白[102]，人類 SQSTM1 由 4氨基酸組成，具有多個功能結(jié)構(gòu)域：氨基末端 PB1 結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)自身

圖 1.3 自噬相關(guān)的人類疾病[130]Figure 1.3 Autophagy-related human diseases1.2 泛素化及泛素連接酶 NEDD41.2.1 泛素化反應(yīng)翻譯后修飾（post-translational modification, PTM）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能多樣化的基本機(jī)制，控制基因組中幾乎所有蛋白編碼基因的活性。在各種 PTM 類型中，泛素化，可共價(jià)結(jié)合 76 個氨基酸組成的小分子多肽泛素（ubiquitin, Ub），在蛋白酶體和溶酶體介導(dǎo)的蛋白降解、膜受體內(nèi)吞、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞自噬中至關(guān)重要。泛素化是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條主要途徑，通過泛素蛋白酶體系統(tǒng) UPS控制蛋白質(zhì)降解。泛素化是一種高度有序的三級聯(lián)酶促過程：活化、交聯(lián)和連接。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 牟婕;馮文靜;王珊;馮美蘋;毛擁軍;;自噬調(diào)控衰老的研究進(jìn)展[J];中華老年多器官疾病雜志;2019年01期

2 李黎;季漪;李文婷;馬艷霞;李沐涵;吳勉華;;基于細(xì)胞自噬的中醫(yī)藥抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥雜志;2019年01期

3 汪艷;;調(diào)控自噬在臨床肝病治療性應(yīng)用的轉(zhuǎn)化研究[J];肝臟;2019年07期

4 韓蘇夏;蔡夢嬌;;自噬在腫瘤治療策略中的角色[J];西部醫(yī)學(xué);2018年09期

5 周岐鳴;劉洋;季光;宋海燕;;調(diào)節(jié)自噬改善非酒精性脂肪性肝病的藥物研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2018年10期

6 李曉瓊;何玲玲;李新毅;;自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究進(jìn)展[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2018年10期

7 馬文科;戴舒惠;羅鵬;楊悅凡;費(fèi)舟;;線粒體自噬的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年06期

8 付婉;董笛;趙穎;;自噬的相關(guān)分子機(jī)制[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2017年05期

9 方聰聰;毛善平;董慧敏;劉寶輝;王舜;;線粒體自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];卒中與神經(jīng)疾病;2017年02期

10 李旭卉;吳習(xí)習(xí);張凱;羅海霞;李敏;;線粒體自噬與癌癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張海;鎘通過抑制自噬流和激活A(yù)kt-Beclin1通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬關(guān)聯(lián)凋亡的機(jī)理研究[D];南京師范大學(xué);2019年

2 隋天琪;高爾基體膜蛋白1通過影響自噬調(diào)控抗腫瘤免疫應(yīng)答的機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2019年

3 趙陽;水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）感染與細(xì)胞自噬的相關(guān)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

4 張華璐;鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體Zip7對線粒體自噬的調(diào)控作用及分子機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

5 張斌;自噬在高碘誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞及大鼠海馬組織凋亡中的作用研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

6 李琦;MST1激活JNK/p53通路抑制線粒體自噬調(diào)控直腸癌細(xì)胞生長的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

7 許悅;沙門氏菌新型效應(yīng)蛋白揭示細(xì)菌自噬通路機(jī)制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

8 李芮冰;Sirtuin 3通過調(diào)節(jié)Bnip3介導(dǎo)的線粒體自噬改善非酒精性脂肪性肝病的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2019年

9 徐將;SIRT1/FOXO1介導(dǎo)的自噬對糖尿病腎病的影響及二甲雙胍作用機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2019年

10 孫愛琴;泛素連接酶NEDD4調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的機(jī)理研究[D];江蘇大學(xué);2019年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張婧婷;JNK促進(jìn)甲型流感病毒復(fù)制的分子機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

2 周鈺奇;硒對金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬影響的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

3 余鑫;自噬在機(jī)械通氣致大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡中的作用[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

4 王婷;自噬或鐵死亡協(xié)同的光敏抗腫瘤活性研究[D];南京師范大學(xué);2019年

5 陳興興;草魚細(xì)胞中活化的STAT3能通過對Bcl-2進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而緩解自噬[D];南昌大學(xué);2019年

6 凌仕誠;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自噬與凋亡緩解高脂誘導(dǎo)黃顙魚腸道脂肪沉積的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

7 馮婭琳;褐飛虱線粒體自噬相關(guān)基因的克隆與功能研究[D];中國計(jì)量大學(xué);2018年

8 劉詩語;氯化鑭誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化應(yīng)激對JNK相關(guān)信號通路活化狀態(tài)和自噬相關(guān)基因表達(dá)水平的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

9 周冰倩;自噬在蛋白尿誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中作用的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

10 牛佳媛;七氟醚后處理通過IRE1/JNK/beclin1信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號：2887843