機體可通過誘導天然免疫反應和適應性免疫反應殺滅和清除入侵的病原體以維持機體的穩(wěn)定與健康,但是,一旦其活化調(diào)控異常則會引發(fā)諸多炎癥性疾病。巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞以及中性粒細胞等天然免疫細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PPRs)識別病原體的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信號通路,誘導產(chǎn)生炎性因子、招募和激活更多的免疫細胞以吞噬和清除病原體。PPRs包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)、RIG-I樣受體(RIG-I-like receptors,RLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)和胞漿中識別病毒DNA的受體等。其中,TLR4是特異性識別革蘭氏陰性菌表面脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的模式識別受體。TLR4結(jié)合LPS之后,激活下游的NF-κB(nuclear factor kappa light-chain-enhancer of activated B cells)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信號通路,誘導產(chǎn)生炎性細胞因子。此外,TLR4識別配體之后還會被內(nèi)吞至內(nèi)體,激活IRF3(interferon regulatory factor 3)等信號通路誘導干擾素產(chǎn)生,進一步放大炎癥反應。另外,吞噬細胞通過內(nèi)吞作用將病原體吞噬,再通過細胞內(nèi)囊泡將病原體先后運送至內(nèi)體和溶酶體,在溶酶體的酸性環(huán)境中,病原體被溶酶體水解酶降解,其降解產(chǎn)物可以形成抗原多肽遞呈至組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC),在抗原提呈細胞共刺激因子的作用下激活CD4~+和CD8~+T細胞,激活適應性免疫反應。小窩(caveolae)是細胞膜上一種特殊的脂筏,其在電鏡下形態(tài)為細胞膜的球狀內(nèi)陷。小窩具有重要的生理功能,目前發(fā)現(xiàn),小窩能夠介導細胞吞噬病原體、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)平衡、參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、緩沖細胞膜受到的機械力,甚至還參與癌癥的發(fā)生與發(fā)展。小窩的組成成分復雜,主要包括蛋白和脂質(zhì)。組成小窩的蛋白主要為小窩蛋白(caveolins)家族和小窩相關蛋白(caveolae associated proteins,Cavins)家族成員。Caveolins家族有三個成員,分別是caveolin-1(Cav1),caveolin-2(Cav2)和caveolin-3(Cav3)。其中,Cav1是形成小窩的必要因素,除參與小窩形成外,Cav1在信號轉(zhuǎn)導、脂質(zhì)代謝以及腫瘤發(fā)生等發(fā)面發(fā)揮著重要的作用。Cav2不是組成小窩的必要蛋白,但Cav2可以協(xié)同Cav1促進小窩的形成。鑒于Cav1具有的生物學功能及其在細胞吞噬中的重要作用,為了進一步研究細胞吞噬和清除病原體的關鍵調(diào)節(jié)因子,我們通過質(zhì)譜(MS)技術(shù)去發(fā)現(xiàn)和鑒定Cav1的相互作用蛋白。在質(zhì)譜結(jié)果中,我們篩選出與Cav1結(jié)合的蛋白質(zhì)分子LAPF(lysosome-associated and apoptosis-inducing protein containing PH and FYVE domains,or PLEKHF1)。LAPF是由我們實驗室2005年通過人骨髓基質(zhì)細胞cDNA文庫大規(guī)模隨機測序首先發(fā)現(xiàn)并克隆的分子。我們先前的工作發(fā)現(xiàn),LAPF通過招募磷酸化P53蛋白至溶酶體并破壞溶酶體穩(wěn)定性,促進TNFα誘導的半胱天冬酶(caspase)非依賴的細胞凋亡。但LAPF在天然免疫,尤其是其在細菌吞噬和清除中的功能還沒有相關報道,值得進一步研究。為了研究LAPF在細胞吞噬和清除細菌中的作用,我們構(gòu)建了髓系細胞特異性敲除Lapf基因的Lapf ~(fl/fl)-LysMcre(Lapf~(-/-))小鼠,并以同窩的Lapf ~(fl/+)-LysMcre(Lapf~(+/-))小鼠作為對照組。Lapf基因缺陷的巨噬細胞吞噬碘化丙啶(propidium iodide,PI)標記的滅活大腸桿菌(E.coli)的數(shù)量顯著少于對照組。Lapf~(-/-)巨噬細胞吞噬E.coli、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、酵母聚糖(Zymosan)和乳膠珠(Latex beads)的能力也明顯減弱,說明Lapf基因缺陷影響巨噬細胞的吞噬能力,提示LAPF促進巨噬細胞的吞噬能力。接下來我們分析Lapf基因缺陷是否影響巨噬細胞的殺菌能力。我們用E.coli分別感染Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬細胞一定時間,記錄巨噬細胞吞噬細菌的數(shù)量,再過一段時間后觀察巨噬細胞內(nèi)的活菌數(shù)占原吞噬數(shù)的百分比。我們發(fā)現(xiàn)Lapf~(-/-)的巨噬細胞內(nèi)的活菌數(shù)百分比顯著高于Lapf~(+/-)的巨噬細胞,說明Lapf基因缺陷降低了巨噬細胞清除細胞內(nèi)細菌的效率,提示LAPF促進巨噬細胞殺滅細胞內(nèi)細菌的能力。以上體外實驗的結(jié)果說明了LAPF在巨噬細胞吞噬和清除細菌過程中發(fā)揮著重要的作用,那么其在體內(nèi)細菌感染過程中效應如何呢?我們用E.coli分別感染Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)小鼠,發(fā)現(xiàn)Lapf~(-/-)小鼠在細菌感染之后更容易死亡。進一步研究發(fā)現(xiàn),Lapf~(-/-)小鼠脾臟和肝臟的荷菌量顯著高于對照小鼠,血清中TNFα、IL-6和IFNβ等細胞因子水平顯著低于對照小鼠。組織學檢測顯示Lapf~(-/-)小鼠肺部炎癥細胞浸潤程度明顯低于Lapf~(+/-)小鼠。這些結(jié)果說明,巨噬細胞Lapf缺陷的小鼠在細菌感染過程中清除體內(nèi)細菌的能力減弱,炎癥反應減弱,且更容易死亡,提示LAPF促進小鼠抵抗細菌感染的能力。Lapf~(-/-)小鼠在細菌感染時體內(nèi)炎癥反應減輕,是由于巨噬細胞吞噬細菌減少不能有效激活體內(nèi)的炎癥反應么?LAPF在TLR4介導的炎癥反應中效應如何呢?我們將Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)小鼠腹腔注射LPS,發(fā)現(xiàn)Lapf~(-/-)小鼠血清中的炎性因子水平顯著低于對照小鼠。我們用LPS刺激Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)Lapf~(-/-)巨噬細胞產(chǎn)生的TNFα、IL-6和IFNβ等細胞因子顯著低于對照細胞。通過Western blot檢測Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬細胞TLR4介導的NK-κB和MAPK等信號通路的激活,我們發(fā)現(xiàn)Lapf~(-/-)巨噬細胞的TBK1、IRF3、IKKα/β、P65、JNK、ERK1/2和P38等信號分子的磷酸化水平均顯著低于對照組,而過表達LAPF的RAW264.7細胞中,LPS誘導的IRF3和P65的活化增加,說明LAPF促進TLR4介導的炎癥反應。我們繼續(xù)檢測了LPS刺激后Lapf~(+/-)和Lapf~(-/-)巨噬細胞表面的TLR4水平,發(fā)現(xiàn)在Lapf~(-/-)巨噬細胞中,LPS誘導的TLR4內(nèi)吞減少,說明Lapf缺陷通過阻礙TLR4內(nèi)吞減弱LPS誘導的炎癥反應,提示LAPF通過促進TLR4內(nèi)吞從而促進LPS誘導的炎癥反應。LAPF是如何調(diào)節(jié)巨噬細胞吞噬細菌的呢?我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞通過caveolae介導的內(nèi)吞作用吞噬E.coli,而LAPF分別與Cav1和Cav2共定位且相互作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),特異性抑制小窩介導的內(nèi)吞阻礙了LAPF介導的巨噬細胞吞噬E.coli。這些結(jié)果說明LAPF通過caveolae介導的內(nèi)吞促進細胞吞噬細菌。我們進一步研究LAPF通過caveolae促進細胞吞噬細菌的分子機制。通過免疫熒光實驗,我們確定LAPF定位于早期溶酶體。我們用Western blot實驗檢測了Lapf的缺陷后Cav1或Cav2的表達量,發(fā)現(xiàn)LAPF并不影響Cav1和Cav2的表達。那么LAPF是否影響了caveolae形成呢?我們檢測LAPF是否可以促進Cav1和Cav2的聚集,發(fā)現(xiàn)LAPF既可以促進Cav1的寡聚化,也可以促進Cav1和Cav2的異聚化。這些結(jié)果說明LAPF通過促進caveolae的Cav1和Cav2的聚集,促進caveolae的形成,進而促進細胞吞噬E.coli。最后,我們研究了LAPF的翻譯后修飾及活化機制。通過免疫共沉淀實驗我們發(fā)現(xiàn),LAPF可以被Src磷酸化。我們構(gòu)建了一系列LAPF的酪氨酸殘基位點突變質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)LAPF分子內(nèi)的第208位或268位酪氨酸突變后,LAPF的磷酸化明顯減少。LAPF-Y208F/Y268F與Src和Cav1相互作用明顯減弱,促進Cav1與Cav2聚集的效應也明顯減弱。我們檢測過表達LAPF突變體的細胞吞噬細菌的能力。過表達LAPF-Y268F不能促進A549細胞對細菌的吞噬,且過表達CA-Src/LAPF-WT的A549吞噬細菌的數(shù)量顯著高于過表達CA-Src/LAPF-Y268F的細胞。這些結(jié)果說明,磷酸化LAPF在細胞吞噬細菌的過程中發(fā)揮了關鍵作用。由此我們推測,LAPF被Src磷酸化后,增加LAPF-Src-Cav1復合體形成,促進caveolins聚集,進而增加caveolae的形成,以進一步提高細胞吞噬細菌的能力。我們發(fā)現(xiàn)在E.coli感染時,巨噬細胞內(nèi)會形成LAPF-Src-Cav1復合體,而在Lapf基因缺陷的巨噬細胞內(nèi),Src與Cav1的相互作用明顯減弱,這些結(jié)果表明,磷酸化LAPF對LAPF-Src-Cav1復合體形成以及Src與Cav1相互作用十分重要。通過Western blot分析,我們發(fā)現(xiàn)Src抑制劑達沙替尼(Dasatinib)抑制LAPF-Src-Cav1復合體形成。進一步研究發(fā)現(xiàn),Dasatinib預處理的Lapf~(+/-)巨噬細胞吞噬的細菌數(shù)量顯著減少,而Dasatinib預處理的Lapf~(-/-)巨噬細胞吞噬細菌的數(shù)量與對照組(DMSO處理)沒有明顯差異,說明Dasatinib抑制細胞吞噬細菌。在體內(nèi)實驗中,我們發(fā)現(xiàn)Dasatinib預處理的小鼠在細菌感染時更容易死亡。這些結(jié)果說明Dasatinib抑制細胞吞噬細菌,降低了小鼠的抗感染能力,也進一步驗證了抑制LAPF-Src-Cav1復合體形成可以抑制細胞對細菌的吞噬。綜上所述,在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了LAPF促進細胞吞噬和清除細菌的關鍵作用,揭示了LAPF促進宿主抵抗細菌感染的新機制,為抗感染藥物的研發(fā)提供了新的潛在靶點。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：
帶 Flag、myc 和 V5 標簽抗體的瓊脂糖親和凝膠珠購于以及熒光標記的 Lds 購于 Sigma-Aldrich 公司。Dasatinib 購于 Selleck 公司。蛋白緩沖液on-X-100 和 DMSO 購于上海生工生物工程股份有限公司�？焖巽y染試劑盒、光實驗所用的碘化丙啶（PI）以及 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dihydrochloridPI）購于碧云天公司。.4 分子克隆載體和菌株分子克隆實驗中所用的空載體 pcDNA3.1（-）B 購于 Invitrogen 公司，經(jīng)本李楠教授改造，在其 C-端加入 Flag、myc、HA 或 V5 等標簽序列，作為真質(zhì)粒載體。以帶 Flag 標簽的表達載體為例，其質(zhì)粒圖譜如下（圖 2-1）。分子驗所用KOD plus試劑盒購于TOYOBO公司，同源重組試劑盒購于諾唯贊公性內(nèi)切酶 EcoR I、BamH I、Hind III、DNA 連接酶 Solution I 以及構(gòu)建點突所用的 Dpn I 酶等均購于 Takara 公司。轉(zhuǎn)化用感受態(tài) E.coli DH5α 菌株購于公司。DNA 膠回收試劑盒和 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購于 AXYGEN 公司。提試劑盒購于 Invitrogen 公司。
圖 2-2 Lapf 基因敲除策略Figure 2. Lapf gene knockout strategyB6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J （LysMcre） 小鼠購于 Jackson Lab 公司，是髓系細表達 cre 酶的小鼠。將適齡的 LyzMcre 小鼠與 Lapffl/fl或 Lapffl/+小鼠雜交后得到件性敲除髓系細胞中 Lapf 基因的 Lapffl/fl-LysMcre（Lapf-/-）小鼠和同窩對照 Lafl/+- LysMcre （Lapf+/-）小鼠。2.2.2 條件性基因敲除小鼠的鑒定將待鑒定小鼠尾巴末端剪下約 3mm，放入 1.5ml 離心管中，加入組織裂解液蛋白酶 K 后，將其放入 55°C 水浴鍋中過夜。使用細胞/組織基因組 DNA 提取試盒（購于上海捷瑞生物技術(shù)有限公司）提取鼠尾基因組 DNA，再進行 PCR 鑒定PCR 鑒定所用 DNA 聚合酶 Extaq 購于 Takara 公司，鑒定引物由上海生工生物工股份有限公司合成。小鼠 PCR 鑒定引物序列如下：
rd/ Reverse（10μM） 各 0.2μlNA 2μl（<10ng）5.1μl：reture Time2min20s20s40 個循環(huán)1min10minHold在 1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離。ox 純合子（Lapffl/fl）在 369bp 處有明條帶，F(xiàn)lox 雜合子（Lapffl/+）在 369
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本文編號：
2894118
