發(fā)布時間：2020-11-04 09:57

　　 背景:急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是臨床工作中常見嚴重呼吸系統(tǒng)疾病,發(fā)展快,病死率高。ARDS患者常表現(xiàn)為呼吸困難和頑固的低氧血癥。盡管急性肺損傷在臨床上日益受到重視,但是目前仍缺乏有效的治療手段,尋找一個更加有效的新治療方法迫在眉睫。隨著人們對間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其作為成體干細胞,具有強大的增殖能力、多向分化潛能以及免疫調節(jié)功能,可作為理想的種子細胞修復組織器官損傷,有研究表明其對ALI和ARDS的治療具有一定的臨床應用價值,可能是一種潛在的、有前景的新治療方法。但是,肺損傷微環(huán)境中的高氧化應激狀態(tài)很大程度上嚴重制約著外源MSC的修復功能。肺損傷微環(huán)境中可產生大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),移殖的MSC很容易暴露在高活性氧自由基環(huán)境中,從而過早的出現(xiàn)凋亡使定植于肺部的MSC數(shù)量減少,極大地影響了 MSC治療急性肺損傷的療效,因此,如何改善移植后微環(huán)境,提高移植細胞的存活率是目前MSC治療ALI/ARDS所要面臨的重要課題。還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)在線粒體氧化還原反應中扮演核心角色。GSH是細胞內的主要抗氧化物,近年來有大量研究表明GSH可以有效的治療器官的氧化應激損傷,且已應用于臨床。本課題基于MSC治療肺損傷,但是在肺部高氧化應激狀態(tài)下,MSC容易出現(xiàn)過早凋亡,所以研究GSH能否有效提高MSC的肺部定植率,使其在肺損傷高氧化應激微環(huán)境中發(fā)揮更好的治療作用有重要意義。目的:探究還原型谷胱甘肽對大鼠骨髓間充質干細胞的氧化應激保護作用及其對間充質干細胞治療急性肺損傷的影響。方法:1、大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定:分離大鼠股骨及脛骨骨髓腔內細胞,使用細胞貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞,并應用流式細胞術檢測技術鑒定細胞表面標記物,應用成脂及成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定MSC的多項分化潛能。2、觀察谷胱甘肽對高氧化應激環(huán)境中MSC的影響:利用過氧化氫(1mmol/L)制作高氧化應激損傷模型,使用還原性谷胱甘肽(5mmol/L)制作抗氧化模型。流式法觀察細胞凋亡率及細胞內ROS水平,蛋白免疫印跡(Western blot)測定細胞bcl-1、p53、p-jnk蛋白表達情況。3、肺損傷模型的建立和MSCs肺內示蹤:利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)經(jīng)鼠尾靜脈注射建立大鼠ALI模型,再經(jīng)鼠尾靜脈注射染色劑標記的MSCs。在MSCs注射后的15min,2h,24hand 72h幾個時間點分別麻醉并處死大鼠,取出肺組織,利用小動物成像儀分析MSCs在大鼠肺內的留存情況,了解MSCs在大鼠肺內的分布。4、病理評價及肺濕/干重比:各組大鼠處理后獲取全肺組織,左側肺葉制作石蠟切片并HE染色,右側肺葉測濕/干重。5、統(tǒng)計學分析:本試驗數(shù)據(jù)均為計量資料,所有數(shù)據(jù)表達為X±SD,采用SPSS13.0分析軟件。單組計量資料采用t檢驗;3組以上獨立樣本采用單因素方差分析(One-way ANOVA),重復測量資料采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,P值小于0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結果:1、大鼠骨髓間充質干細胞在培養(yǎng)皿呈貼壁生長。CD29,CD44,CD90和CD105在細胞中呈陽性表達,CD34和CD45呈陰性表達。成骨成脂誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)后染色可見脂肪小滴及骨組織。2、過氧化氫對骨髓間充質干細胞處理后,細胞存活率下降,凋亡率升高,細胞內ROS水平升高,p53、p-jnk蛋白表達水平上升,bcl-1蛋白表達水平下降;而谷胱甘肽組的細胞存活率上升,凋亡率降低,細胞內ROS水平下降,p53、p-jnk蛋白表達水平下降且bcl-1蛋白表達水平提高。3、染色標記的MSCs經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內后,可觀察到注射后15min時肺內有大量的MSCs存留,隨后MSCs在肺內逐步減少,72h肺內依然有少量MSCs留存。GSH處理后的MSC在注射后的2h、24h兩個時間點內肺部定植率明顯高于對照組。4、大鼠尾靜脈注射LPS后,病理結果提示肺泡內炎性細胞浸潤和肺泡間隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性滲出液減少和肺泡間隔變窄。肺組織濕/干重比在大鼠注入LPS后升高,在尾靜脈注入MSCs后濕/干重下降。GSH組的濕/干重比與對照組相比雖然數(shù)值較低但無統(tǒng)計學差異。結論:1、過氧化氫可導致骨髓間充質干細胞氧化應激損傷,還原性谷胱甘肽能有效減少細胞內ROS水平,并且通過影響相關蛋白的表達從而起到減少細胞凋亡的作用,具有氧化應激保護機制2、GSH處理后的MSC在注射后的2h、24h兩個時間點在肺部定植率明顯高于對照組,說明GSH在體內也可明顯減少MSC的凋亡。3、MSC對LPS介導的大鼠急性肺損傷有明顯的治療效果。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R563.8
【部分圖文】：

圖１．．分離培養(yǎng)早期可見細胞團出現(xiàn)，細胞呈放射樣生長，傳代后可見成熟的梭型大鼠骨髓充質干細胞密集生長。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｍａｓｓ?ａｐｐｅａｒｅｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｅａｒｌｙ?ｓｔａｇｅ，?ｗｅ?ｃａｎ?ｏｂｓｅｒｖｅ?ｍａｔｕｒｅ?ｓｐｉｎｄｌｅ?ｂｏｎｅ?ｍａｒｒｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ?ｔｈａｔ?ｗｅｌｌ?ｇｒｏｗｉｎｇ．??２．２大鼠骨髓間充質干細胞的成脂及成骨分化??將第四代生長情況良好的ＭＳＣｓ放入成骨及成脂誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，??按上文方法定期換液。成骨誘導１４天后用甲醛固定，茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)紅染的不規(guī)則鈣化組織（圖２Ａ）。成脂誘導１７天后，用甲醛固定，油紅溶液染色，顯微鏡下觀察細胞中出現(xiàn)紅染的圓形脂肪小滴（圖２Ｂ）??

將第四代生長情況良好的ＭＳＣｓ放入成骨及成脂誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，??按上文方法定期換液。成骨誘導１４天后用甲醛固定，茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)細胞中??出現(xiàn)紅染的不規(guī)則鈣化組織（圖２Ａ）。成脂誘導１７天后，用甲醛固定，油紅０??溶液染色，顯微鏡下觀察細胞中出現(xiàn)紅染的圓形脂肪小滴（圖２Ｂ）??１４??

將大鼠骨髓間充質干細胞按上述方法經(jīng)ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、??ＣＤ９０、ＣＤ１０５等抗體孵育后，放入流式細胞儀中測試，發(fā)現(xiàn)ＣＤ２９，?ＣＤ４４，?ＣＤ９０??和ＣＤ１０５抗體呈高表達，而ＣＤ４５，ＣＤ３４抗體呈低表達（圖３）。??１５??
【參考文獻】

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本文編號：2869952