發(fā)布時間：2020-11-18 02:30

　　 研究背景:由于地震、車禍等災難的發(fā)生,坐骨神經(jīng)等周圍神經(jīng)的損傷是臨床的常見疾病。目前,自體神經(jīng)移植仍然是修復周圍神經(jīng)損傷的主要方法,但是自體神經(jīng)移植法具有供體來源有限、增加供區(qū)創(chuàng)傷以及殘留供區(qū)感覺功能障礙等缺陷。周圍神經(jīng)再生是現(xiàn)階段神經(jīng)生物學領(lǐng)域的研究重點,組織工程領(lǐng)域的一些新發(fā)現(xiàn)為長節(jié)段缺損性損傷提供了新手段。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)可分化為各種類型的神經(jīng)細胞,將其移植到損傷處可促進軸突再生以及髓鞘形成。課題組此前通過培養(yǎng)人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞可以自發(fā)分化形成神經(jīng)干細胞。由此我們推測這種人胚胎干細胞能夠在特定條件下定向誘導分化成純度較高的神經(jīng)干細胞(human embryonic stem cell derived-neural stem cells,hESC-NSCs)。由于神經(jīng)干細胞來源的局限性,從hESCs分化而來的NSCs顯得尤為重要。能否高純度、高產(chǎn)量的獲得NSCs是其能否應用到臨床細胞治療的關(guān)鍵問題。我們猜測,hESC-NSCs同胎腦來源的NSCs具有同樣促進軸突再生的作用,對此后續(xù)的研究表明,hESC-NSCs確實可以通過間接作用促進軸突再生。現(xiàn)在越來越多的研究表明NSCs發(fā)揮修復神經(jīng)損傷的作用不是通過細胞直接整合而是通過分泌因子發(fā)揮作用,并且由于NSCs是有核的活細胞,具有形成腫瘤的風險。微囊泡(microvesicles,MVs)是從細胞條件培養(yǎng)基中分離得到的活性有形成分,是細胞同周圍細胞或環(huán)境進行信息和物質(zhì)傳遞的一種物質(zhì)。并且我們組之前已經(jīng)研究證明過間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源的微囊泡(MSCs-MVs)可以促進坐骨神經(jīng)壓榨性損傷后的再生修復。因此,我們猜測人胚胎干細胞源神經(jīng)干細胞分泌的微囊泡(microvesicles released from human embryonic stem cell derived-neural stem cells,hESC-NSC-MVs)與MSCs-MVs具有類似的促進軸突再生的功能,并對其展開進一步的研究。研究目的:研究人胚胎干細胞的神經(jīng)干細胞誘導分化及胚胎干細胞源神經(jīng)干細胞分泌的微囊泡對大鼠坐骨神經(jīng)5mm缺損性損傷的修復作用。研究方法:(1)將無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的hESCs定向誘導為神經(jīng)干細胞,并利用細胞形態(tài)學、免疫熒光、PCR的方法進行鑒定。(2)利用PCR和流式細胞術(shù)對神經(jīng)干細胞經(jīng)過貼壁-球轉(zhuǎn)化(AST)后提高干性進行說明。(3)收集hESC-NSCs的無血清培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基),運用超速離心法提取微囊泡。(4)將hESC-NSC-MVs與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng),測定軸突的長度。(5)建立SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損性損傷模型,應用坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve functional index,SFI)、HE染色、Masson染色等方法評價hESC-NSC-MVs對大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復作用。研究結(jié)果:(1)hESCs可以分化為神經(jīng)干細胞,并且神經(jīng)干細胞相關(guān)標志Nestin,Pax6等在P8 NSCs附近表達最高。(2)神經(jīng)干細胞經(jīng)過AST,神經(jīng)干細胞相關(guān)標志Nestin,Pax6等表達升高,干性增強。(3)hESC-NSC-MVs與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)的再生軸突長度優(yōu)于PBS組。(4)成功的構(gòu)建出大鼠坐骨神經(jīng)缺損性損傷模型。神經(jīng)損傷后12周,hESC-NSC-MVs組受損側(cè)后肢形態(tài)學恢復和再生軸突的增加都較hESC-NSCs組和PBS組明顯。結(jié)論:(1)hESC可以分化為NSCs,hESC-NSCs表達神經(jīng)干細胞標志。(2)hESC-NSCs可以通過貼壁-球轉(zhuǎn)化提高神經(jīng)干細胞標志的表達以及增強干性。(3)hESC-NSC-MVs對坐骨神經(jīng)缺損性損傷具有修復作用。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R745
【部分圖文】：

邊緣清晰光滑（圖3.1A）。在神經(jīng)誘導液中培養(yǎng)約 18d 后，細胞開始呈橢圓形、三角形、雙極型或三極型。當達到 75%以上的融合度時，消化細胞并重新接種在 Matrigel 培養(yǎng)皿，這些細胞可以傳代至少 50 代（目前還能繼續(xù)往下傳代），同時保持其特有的形態(tài)大致不變，并可反復凍存和復蘇（圖 3.1B-D）。通過 PCR 和免疫熒光分析，檢測 NSCs 標志物的表達情況。與 hESCs 相比，Pax6、Sox 1 等神經(jīng)干細胞基因在 hESC-NSCs 中明顯上調(diào)，而多能干性基因 Oct 4 表達下調(diào)（圖 3.1 E）。圖3.1：hESCs及hESC-NSCsA：生長在matrigel上的hESCs形態(tài)；B-D：P8

15分析顯示，hESC-NSCs細胞表面表達CD 44和CD 133，弱表達O1，而Neisin、β-IIItubulin和GFAP在hESC-NSCs的細胞質(zhì)中表達（圖3.2 C-D）。圖3.2：P8 hESC-NSCs神經(jīng)標志物的表達及細胞定位A-B：hESC-NSCs的Nestin (A)和Pax6 (B)免疫熒光染色；C-D：P8 hESC-NSCs細胞膜表達Nestin, β-III tubulin, GFAP, O1, CD133 and CD44的分析(C)；細胞內(nèi)表達 Nestin, β-III tubulin,GFAP的分析(D)（A-B：Scale bars 50 μm）。Fig.3.2 Cellular localization of P8 hESC-NSCs markersA-B: hESC-NSCs were immunofluorescence staining for Nestin (A), Pax6 (B). C-D: Cellsmembrance analysis of Nestin

16這些hESC-NSCs可傳代50代，且形狀大致保持不變。我們使用P2、P8和P18hESC-NSCs來觀察Nestin、Pax6、Sox1、Sox2的表達（圖3.3A）。流式細胞儀分析顯示，Nestin、β-III tubulin、GFAP、O1、CD133在P2、P8和P18 hESC-NSCs中的表達(圖3.3B)。圖3.3 不同代數(shù)的hESC-NSCs上神經(jīng)標志物的表達A：定量 PCR 分析 Nestin，Pax6，Sox1，Sox2 在 P8 hESC-NSCs，P18 hESC-NSCs 的表達水平，以 P2 hESC-NSCs 作對照（n=3，*p<0.05
【參考文獻】

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本文編號：2888233