發(fā)布時(shí)間：2024-07-06 08:10

　　白細(xì)胞介素-24(IL-24),又名黑色素瘤分化相關(guān)基因-7(mda-7), mda-7/IL-24是一種廣譜性抗腫瘤藥物,可以選擇性摧毀腫瘤細(xì)胞但是對(duì)正常細(xì)胞或者組織沒(méi)有傷害。 本論文選取E.coli BL21(DE3)為宿主菌,pET-28a(+)為表達(dá)載體,成功實(shí)現(xiàn)了mda-7/IL-24的異源構(gòu)建與表達(dá),蛋白表達(dá)量約為29.6%,重組蛋白為包涵體。 包涵體的變復(fù)性。探討了不同濃度的尿素、鹽酸胍及精氨酸的添加對(duì)mda-7/IL-24包涵體的溶解效果,優(yōu)化后的變性緩沖液為20mM Tris,10mM EDTA,8M urea, pH9.5。經(jīng)6次不同緩沖液逐步透析復(fù)性：尿素濃度遞減(6M-3M-1.5M-0.75M-0M-0M),pH梯度逐漸減少(9.5-9.0-8.5-8.0-7.5-7.4),靜水壓采用0.5-1.0kPa,添加還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽10：1,甘油濃度遞減(20%-15%-10%-5%-0%-0%),最終得到溶于PBS中的IL-24蛋白。 本論文還優(yōu)化了發(fā)酵條件以改善包涵體結(jié)構(gòu)。優(yōu)化所得的結(jié)果為：培養(yǎng)基配方為MgSO41.88g/L, CaCl21.84...

【文章頁(yè)數(shù)】：83 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1IL-10家族在1號(hào)染色體上的位置

圖2.1pET-28a(+)的質(zhì)粒圖譜Fig.2.1themapofpET-28a(+)vector

圖1.2IL-IO家族成員一級(jí)結(jié)構(gòu)

圖2.4PCR法驗(yàn)證陽(yáng)性克隆的凝膠電泳圖Fig.2.4agaroseelectrophoresisofverificationofpositiveclonebyPCRM:DNAMaker；1-7:陽(yáng)性單克隆菌落PCR產(chǎn)物性克隆菌的測(cè)序分析

圖1.3inda-7/IL-24空間結(jié)構(gòu)模式圖

3:誘導(dǎo)后菌種裂解液沉淀4:誘導(dǎo)后菌種裂解液上清表達(dá)rnda-7/IL-24目的蛋白的Westernblot檢驗(yàn)如圖2.7，可以看出重組蛋白可以與mda-7/IL-24抗體發(fā)生反應(yīng)

圖1.4IL-24介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能的途徑Fig.1.4ModelillustratingthepossiblemolecularbasisofIL-24cancercell-mediatedapoptosis

間的相互作用，減少?gòu)?fù)性中蛋白的再聚集。但本實(shí)驗(yàn)中，先純化后復(fù)性的方法卻不是很理想，如圖3.5所示中的泳道1、2和9，可以看到上樣后大部分的蛋白都穿出了，也就是大部分的mda-7/IL-24蛋白沒(méi)有與鎳親和層析柱結(jié)合。為了提高掛柱量，將樣品循環(huán)上樣，發(fā)現(xiàn)5次循環(huán)后，樣品蛋白仍舊大量....

本文編號(hào)：4002308